王友升，張 燕，陳玉娟

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

5株桃、李果實(shí)采后褐腐病菌鑒定、rDNA ITS序列與碳源代謝指紋圖譜分析

王友升，張 燕，陳玉娟

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

從采后貯藏過(guò)程中發(fā)病的桃、李果實(shí)中分離到5株絲狀病原真菌。對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征觀察以及核糖體rDNA ITS序列分析和95種碳源代謝指紋圖譜分析。結(jié)果表明：5株病原真菌均為果生鏈核盤(pán)菌(Monilinia fructicola)，其中091#和089#菌與Monilinia fructicola(FJ515894)的親緣關(guān)系較近。5株褐腐病菌對(duì)D-果糖、麥芽糖、蔗糖等共56種碳源的代謝能力相同，包括51種最適碳源和5種不可利用碳源，其中Monilinia fructicola091#與089#的代謝指紋圖譜最接近，而Monilinia fructicola086#、071#、072#的代謝指紋圖譜最接近。因此利用rDNA ITS序列和碳源代謝指紋圖譜均可區(qū)分桃、李果實(shí)5株褐腐病菌不同菌株之間的差異，且兩種方法具有可比性。

桃果實(shí)；李果實(shí)；褐腐病菌；rDNA ITS序列分析；碳源代謝指紋圖譜

桃、李屬呼吸躍變型果實(shí)，采后呼吸強(qiáng)度大，后熟迅速，加之其皮薄多汁，采收期正值盛夏，極易受到微生物侵染，發(fā)生腐爛[1-2]。低溫、氣調(diào)等常見(jiàn)物理保鮮方法會(huì)降低果實(shí)本身的抗病力，不能有效控制銷售過(guò)程中的腐爛，因而常需配合使用防腐劑。對(duì)引起果實(shí)貯藏期腐爛的主要病原微生物進(jìn)行分離鑒定，是針對(duì)性篩選防腐劑，延長(zhǎng)貨架期的前提。rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)間(internal transcribed spacer，ITS)分析因其可以從較短的核酸序列中獲得種間及種內(nèi)差異，反映生物的親緣關(guān)系及分類關(guān)系，而廣泛應(yīng)用于真菌的鑒定、分類與種屬間系統(tǒng)學(xué)研究。但I(xiàn)TS序列分析法用于菌種鑒定受基因庫(kù)的完善程度、高度同源性序列的多少以及具體物種ITS區(qū)可變程度等因素局限[3]，宜與形態(tài)特征、生長(zhǎng)特點(diǎn)、生理生化指標(biāo)等傳統(tǒng)鑒定方法相結(jié)合[4]。碳源代謝指紋圖譜主要反映微生物對(duì)微平板上不同碳源的利用程度，由此產(chǎn)的不同碳源利用模式即可表征微生物間的差異，常用于真菌的鑒定及同種突變體間的研究[5-6]。

本研究從采后貯藏期發(fā)病的桃、李果實(shí)上分離到5株病原真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征以及rDNA ITS序列分析對(duì)這5株病原菌進(jìn)行鑒定，并通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和碳源指紋聚類分析研究它們的親緣關(guān)系，綜合評(píng)價(jià)兩種方法之間的相關(guān)性，以期為桃、李采后病原真菌的營(yíng)養(yǎng)生理研究、病害防治及真菌種間關(guān)系研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株分離于采后貯藏過(guò)程中自然發(fā)病的‘黑琥珀’李和‘八月脆’桃果實(shí)。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂18g、加水補(bǔ)足1L，121℃滅菌15min。ME培養(yǎng)基：麥芽浸粉20g、瓊脂18g，加入一定量的水中，調(diào)節(jié)pH值至5.5±0.2，121℃滅菌15min。

1.2 試劑與儀器

Tris、EDTA、SDS 美國(guó)Amresco公司； DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、10×PCR Buffer、dNTP、TaqDNA聚合酶 天根生化試劑公司；無(wú)水乙醇、HCl均為分析純。

PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sorvall公司；生物安全柜 美國(guó)Thermo公司；微生物鑒定系統(tǒng) 美國(guó)Biolog公司；Axio Image A1顯微鏡德國(guó)Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離、純化與回接

分離：取發(fā)病果實(shí)病變、健康交界處組織于PDA培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)1～3d。

純化：從分離菌菌落外沿取菌塊，分別轉(zhuǎn)接到PDA和ME培養(yǎng)基上，于25℃條件下培養(yǎng)7d，觀察菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)特征。

回接：挑選健康無(wú)損傷的桃、李果實(shí)，用75%的乙醇將表面消毒，然后用無(wú)菌接種針刺孔，取純化后的菌塊接種至傷口處，觀察果實(shí)接種處是否出現(xiàn)相應(yīng)病癥。

1.3.2 基因組DNA的提取及ITS區(qū)PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定

用改良后SDS-氯化芐法提取基因組DNA[7]。用ITS區(qū)擴(kuò)增通用引物ITS-4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS-5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通用引物ITS-4和ITS-5由Invitrogen公司合成。PCR產(chǎn)物由華大基因進(jìn)行脫鹽、純化和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，并且構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.3.3 碳源代謝指紋圖譜分析

將待測(cè)菌株在PDA培養(yǎng)基平板上26℃培養(yǎng)120h，用FF-IF濁度標(biāo)準(zhǔn)液配制菌懸液，調(diào)節(jié)T＝(75±2)%。在FF微孔板中每孔加100μL菌懸液，26℃培養(yǎng)，每24h用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)讀取結(jié)果，獲得病原菌的代謝指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

圖1 桃、李果實(shí)病原真菌的分離與回接Fig.1 Isolation and re-inoculation of pathogenic strains in peach and plum fruits

2.1 菌株的分離、純化與回接由圖1可知，從‘黑琥珀’李果實(shí)中分離到4株菌，其中091#和089#菌從20℃貯藏1d的果實(shí)中分離得到086#菌從1℃貯藏30d出庫(kù)后并于20℃貯藏6d的果實(shí)中分離得到，071#菌分離自1℃貯藏60d出庫(kù)后并于20℃貯藏6d的果實(shí)；072#菌分離自‘八月脆’桃果實(shí)。將分離得到菌株純化后回接到健康的桃、李果實(shí)上，在接種部位均出現(xiàn)同樣的病癥，并能從該病害部位再次分離得到相應(yīng)病原菌，因此，可確定它們均為桃、李果實(shí)的致病菌。

2.2 病原菌形態(tài)觀察與分析

2.2.1 病原菌菌落形態(tài)觀察

圖2 桃、李果實(shí)5株病原菌在PDA和ME在25℃條件下培養(yǎng)7d的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of five isolated strains cultured in ME and PDA media for 7 days at 25 ℃

由圖2可知， 5株病原菌在PDA培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)旺盛，ME培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較PDA平板弱，091#菌株尤為突出，091#在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，菌絲已鋪滿平板，淺褐色，簇生絨毛狀(圖2a1)，而ME培養(yǎng)基上7d后，菌絲幾乎沒(méi)有擴(kuò)展(圖2a2)。089#、086#、072#菌落特征一致，PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d菌絲鋪滿平板，可以看到明顯的褐色同心輪紋(圖2b1、c1、e1)。ME培養(yǎng)基上菌絲性狀同PDA板上相似，菌落直徑較PDA板上小(圖b2、c2、e2)。071#菌在PDA和ME培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)旺盛，7d后菌絲均鋪滿平板，菌絲白色致密絨毛狀，菌落中央均呈現(xiàn)淺綠色，PDA板中央綠色更深(圖 2d1、d2)。

2.2.2 病原菌顯微鏡觀察

圖3 5株病原菌的顯微形態(tài)觀察Fig.3 Microscopic observation of five isolated strains

由圖3可知，5株病原菌顯微形態(tài)一致，孢子梗具隔，頂端分枝，分生孢子單孢、串生，孢子壁光滑，孢子橢球形或檸檬形(圖3a1～e1)。菌絲分枝多且內(nèi)部隔膜觀察明顯(圖a2～e2)。

2.3 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

采用SDS-氯化芐法提取的5株病原菌總DNA以ITS4和ITS5為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析和紫外檢測(cè)后，可以看出所提取的DNA大小約600bp，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)吻合(圖4)。

圖4 5株病原菌rDNA ITS電泳檢測(cè)圖譜Fig.4 Agarose gel electrophoresis results of rDNA ITS for five isolated strains

2.4 rDNA ITS同源性比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

將分離得到的5株病原菌的rDNA ITS基因部分序列根據(jù)GenBank內(nèi)登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行同源序列比對(duì)，通過(guò)同源性比對(duì)結(jié)果經(jīng)Clustal X軟件和MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖5所示。同源性比對(duì)結(jié)果表明，經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，5株分離菌與Monilinia fructicola(FJ515894) ITS序列同源性皆高達(dá)99%，分別僅差1～6個(gè)堿基。將其形態(tài)特征(圖2)與《真菌鑒定手冊(cè)》[8]中的果生鏈核盤(pán)菌(Monilinia fructicola)的描述進(jìn)行比較，基本一致，5株菌經(jīng)鑒定均為褐腐病原菌果生鏈核盤(pán)菌(M. fructicola)[9]。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上可以看出，5株菌分別位于兩個(gè)分支上，其中Monilinia fructicola089#、091#與Monilinia fructicola(FJ515894)在同一分枝上，Monilini afructicola071#、086#、072#在進(jìn)化樹(shù)的另一分支上。

圖5 以rDNA ITS基因序列為分子標(biāo)記的病原菌菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of five isolated strains based on rDNA ITS sequences

2.5 碳源代謝指紋圖譜分析

表1為5株病原菌對(duì)95種碳源的代謝指紋圖譜，可以看出，不同菌株之間的碳源代謝指紋圖譜存在一定差異，5株菌可以利用的碳源均在68種以上，共有56種利用程度相同的碳源，包括D-果糖、麥芽糖、蔗糖等51種最適碳源和5種不可利用碳源：i-赤藻糖醇、L-海藻糖、葡糖醛酰胺、γ-羥丁酸、腐胺。其中，Monilinia fructicola091#與089#的代謝指紋圖譜最為相近，兩者對(duì)78種碳源利用情況一致，僅對(duì)D-核糖、L-蘇氨酸和α-酮戊二酸3種碳源的利用程度差異較大；與Monilinia fructicola086#代謝指紋圖譜最為相近是Monilinia fructicola072#，其次是Monilinia fructicola071#。Monilinia fructicola086#與072#利用情況相同的碳源有7 8種，利用程度差異較大的碳源僅7種，Monilinia fructicola086#與071#利用情況相同的碳源有76種，利用程度差異較大的碳源僅10種。

聚類分析可將具有相似碳源代謝特征的菌進(jìn)行分類，從而有效反映不同菌株在代謝上的關(guān)系。對(duì)5株Monilinia fructicola采用歐氏距離測(cè)量，每?jī)蓸颖鹃g用Average Linkage法連結(jié)，以95種碳源的利用情況作為聚類變量，進(jìn)行聚類分組，結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯?，通過(guò)系統(tǒng)聚類分析可將5株病原真菌直觀清楚的區(qū)分開(kāi)來(lái)，其中Monilinia fructicola091#與089#、Monilinia fructicola086#與072#首先聚為一類，然后Monilini afructicola071#與086#、072#相聚。

表1 5株褐腐病菌的碳源代謝指紋圖譜Table 1 Carbon source metabolic fingerprinting of five isolated strains

圖6 5株褐腐病菌的碳源特征聚類分析Fig.6 Clustering analysis of five isolated strains by metabolic fingerprints

3 討 論

已報(bào)道[10]桃、李果實(shí)貯藏期的侵染性病害包括褐腐病、根霉病、青霉病、孢霉病和灰霉病等。本研究從采后貯藏過(guò)程的發(fā)病桃、李果實(shí)上多次分離純化病原菌，雖然也可分離出串珠狀赤霉(G i b b e r e l l a moniliformis)、灰葡萄孢(Botrytis elliptica)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)等病原菌(結(jié)果待發(fā)表)，但分離到最多是果生鏈核盤(pán)菌(Monilinia fructicola)。由果生鏈核盤(pán)菌引起的褐腐病是桃、李、櫻桃等核果類果實(shí)采后和貯藏期的主要病害[11]，該菌可以侵染未成熟的果實(shí)，在貯藏期發(fā)病，菌體生長(zhǎng)迅速，極易擴(kuò)散[12]，常引起貯藏、運(yùn)輸和銷售中的大量爛果，損失嚴(yán)重。

侵染性病害的發(fā)病過(guò)程常受到寄主自身營(yíng)養(yǎng)條件的限制。蔗糖、山梨醇、果糖、葡萄糖、蘋(píng)果酸和奎寧酸是桃、李果實(shí)中的主要糖酸組分[13-14]，同時(shí)也是分離到的5株果生鏈核盤(pán)菌的最適碳源(表1)。所以桃、李果實(shí)自身的營(yíng)養(yǎng)特性可能是導(dǎo)致褐腐病成為其貯藏期主要病害的原因。同時(shí)，碳源代謝圖譜表明，5株菌可以利用的碳源均在68種以上，可見(jiàn)果生鏈核盤(pán)菌對(duì)碳源的適應(yīng)性非常強(qiáng)，這可能是褐腐病侵染范圍廣，難以防治的主要原因。

ITS序列進(jìn)化速率相對(duì)較快，可以提供較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛用于解決不同地理分布、種間、種內(nèi)甚至居群間被子植物、低等動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育和分類問(wèn)題[15-16]。本研究分離到的5株果生鏈核盤(pán)菌的ITS區(qū)序列具有一定的變異性，這種變異可能屬于種內(nèi)變異(圖5)。由系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果可以看出，Monilinia fructicola091#跟089#的親緣關(guān)系較近，而Monilinia fructicola086#、071#、072#的親緣關(guān)系較近。碳源代謝指紋分析也可以看出，M o n i l i n i a fructicola091#與089#代謝模式相近，Monilinia fructicola086#、071#、072#菌代謝模式相近，這與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析所揭示的5株果生鏈核盤(pán)菌間的親緣關(guān)系吻合，表明果生鏈核盤(pán)菌之間的遺傳差異同樣可體現(xiàn)在它們的碳源代謝特征上。本課題組前期對(duì)3株羅倫隱球酵母的26S rDNAD1/D2區(qū)序列和代謝指紋圖譜比較，也發(fā)現(xiàn)碳源代謝可以在一定程度上反映親緣關(guān)系[17]。然而，與進(jìn)化樹(shù)結(jié)果相比，碳源代謝指紋圖譜分析還可以將Monilinia fructicola086#、071#、072#的親緣關(guān)系進(jìn)一步細(xì)分，即Monilinia fructicola086#與072#關(guān)系最近，其次是Monilinia fructicola071#。因此，碳源代謝指紋圖譜分析可以為種間變異、種內(nèi)系統(tǒng)學(xué)研究及種下等級(jí)劃分提供新的佐證。

4 結(jié) 論

從采后貯藏期自然發(fā)病的桃、李果實(shí)上分離得到5株絲狀真菌，經(jīng)分子生物學(xué)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定均為果生鏈核盤(pán)菌(Monilinia fructicola)。通過(guò)rDNA ITS序列分析可以看出，5株果生鏈核盤(pán)菌的ITS序列具有一定的變異性。對(duì)95種碳源代謝指紋圖譜的分析表明，5株菌可以利用的碳源均在6 8種以上，其中M o n i l i n i a fructicola091#與089#的碳源代謝指紋相近，而Monilinia fructicola086#、071#與072#的碳源代指紋相近。利用rDNA ITS序列和碳源代謝指紋圖譜均可區(qū)分桃李果實(shí)5株褐腐病菌不同菌株之間的差異，且兩種方法具有可比性。

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Identification, rDNA ITS Analysis and Carbon Metabolic Fingerprinting of FiveMonilinia fructicolaStrains Isolated from Postharvest Peach and Plum Fruits

WANG You-sheng，ZHANG Yan，CHEN Yu-juan
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

In the present study, four pathogenic strains named as 091, 089, 086 and 071, respectively were isolated from infected black amber plum, and one pathogenic strain named as 072 from infected Bayuecui peach during postharvest storage. Morphological observation and rDNA ITS analysis indicated that all five pathogenic strains wereMonilinia fructicola. The result obtained also revealed that strains 091 and 089 had a close phylogenetic relationship with Monilinia fructicola (FJ515894). Metabolic fingerprinting suggested that these five strains had the same ability to metabolize 56 carbon sources including 51 optimal ones and 5 unutilized ones.Monilinia fructicola091 and 089 shared the most similar metabolic fingerprints, whereasMonilinia fructicola086, 071 and 072 were the most similar. These studies demonstrated that both rDNA ITS analysis and carbon metabolic fingerprinting allows distinguishing among theMonilinia fructicolastrains isolated and may be considered as being comparable.

peach fruit；plum fruit；Monilinia fructicola；rDNA ITS sequence analysis；carbon metabolic fingerprinting

Q93-331

A

1002-6630(2012)16-0246-05

2012-04-11

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA101607)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(30901009)；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(6122003)

王友升(1976—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wangys@th.btbu.edu.cn