代 瓊,楊文鴿*,陳小芳,趙月月,熊書利,盧佳芳
(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江 寧波 315211)
魷魚眼透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物的抗氧化和保濕作用
代 瓊,楊文鴿*,陳小芳,趙月月,熊書利,盧佳芳
(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江 寧波 315211)
以魷魚眼中提取的透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物為研究對(duì)象,測(cè)定不同相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)透明質(zhì)酸的保濕作用以及對(duì)Fe3+的還原能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和羥自由基(·OH)的清除能力。結(jié)果表明:透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物的保濕性均優(yōu)于甘油,隨著Mr的增加,保濕能力逐漸增強(qiáng),其中HA-2組分保濕率達(dá)到92.66%;不同Mr的透明質(zhì)酸均有一定的抗氧化作用,其抗氧化活性隨著Mr的降低而增大,Mr為6000以下的透明質(zhì)酸表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除自由基能力,而未降解的透明質(zhì)酸組分HA-1和HA-2的抗氧化能力較弱。
透明質(zhì)酸;相對(duì)分子質(zhì)量;保濕;自由基;抗氧化作用
自由基是人體內(nèi)的正常代謝產(chǎn)物,具有很強(qiáng)的生物活性。適量自由基對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、消炎、解毒等起積極作用,但自由基過多或清除過慢可使許多生物大分子及各種細(xì)胞受到攻擊,從而加速機(jī)體的衰老進(jìn)程,并誘發(fā)炎癥、免疫失調(diào)、惡性腫瘤等多種疾病,其中起作用的主要是質(zhì)子化的超氧陰離子自由基和羥自由基[1],因此具有自由基清除作用的抗氧化劑在防治氧自由基誘導(dǎo)的疾病方面具有很多的應(yīng)用價(jià)值。研究表明,大部分從天然產(chǎn)物中分離得到的多糖類化合物具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等作用[2],其中廣泛存在于動(dòng)物眼玻璃體、皮膚、臍帶、軟骨和關(guān)節(jié)滑液中的透明質(zhì)酸(HA)對(duì)物理、化學(xué)以及生物來源的多種自由基具有清除作用,有望成為天然的抗氧化劑[3]。
保濕劑按其來源可分為天然保濕劑和合成保濕劑。目前在化妝品中最常用的是合成保濕劑甘油,其吸濕性能顯著、保濕性能一般,作為保濕產(chǎn)品還存在一定不足。從天然物質(zhì)中提取的具有營(yíng)養(yǎng)和保濕雙重功能的天然保濕劑符合保濕劑的發(fā)展趨勢(shì),而天然多糖中的透明質(zhì)酸正是這樣一類不可多得的天然保濕材料[3]。
一般認(rèn)為多糖的生物活性與相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)等因素有關(guān)[4],透明質(zhì)酸也不例外。不同Mr的透明質(zhì)酸由于作用機(jī)制不同,表現(xiàn)出不同的生物活性和生理功能,具有明顯的Mr依賴性[3]。魷魚是我國(guó)重要的海洋捕獲物和水產(chǎn)品原料,其加工下腳料魷魚眼(約占魷魚體質(zhì)量2%)資源豐富,同時(shí)富含高相對(duì)分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸[5]。本實(shí)驗(yàn)以魷魚加工下腳料魷魚眼為原料,從中提取透明質(zhì)酸并對(duì)其進(jìn)行降解[6],以對(duì)Fe3+的還原能力、對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基及羥自由基(·OH)的清除能力和保濕率進(jìn)行測(cè)定,評(píng)價(jià)魷魚眼透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物的抗氧化和保濕活性,探討透明質(zhì)酸Mr與其抗氧化和保濕作用之間的關(guān)系,以期為不同Mr透明質(zhì)酸的利用提供參考。
1.1 材料、試劑與儀器
北太平洋魷魚眼睛:來自寧波某魷魚加工廠。取完整魷魚眼睛,清洗破碎,收集眼眶中的液體備用。
Sephadex G-200凝膠 Amersham Pharmacia Biotech AB公司;雙氧水 杭州高晶精細(xì)化工有限公司;丙三醇 浙江中星化工試劑有限公司;鐵氰化鉀 中國(guó)上海試劑廠;DPPH 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社;三氯化鐵 上海展云化工有限公司;水楊酸 天津市博迪化工有限公司。
T6-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;超濾膜組件 天津膜天膜工程技術(shù)有限公司;C-BT600-2J蠕動(dòng)泵 保定蘭格恒流泵有限公司;DK-S24水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;BP211D電子分析天平 德國(guó)塞多利斯股份有限公司;Delta 320 pH計(jì)梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。
1.2 不同相對(duì)分子質(zhì)量透明質(zhì)酸的制備
透明質(zhì)酸:參考盧佳芳等[5]的方法,由實(shí)驗(yàn)室自制。分離純化得到透明質(zhì)酸組分HA-1和HA-2,Mr分別為6.77×105、1.73×106。參考王菁等[6]的方法對(duì)組分HA-2進(jìn)行降解。利用超濾膜截留得到6種不同Mr的樣品液,Mr分別為6×103以下、6×103~1×104、1×104~2×104、5×104~8×104、8×104~1×105及1×105以上,依次記為樣品A、B、C、D、E、F。將樣品A、B、C、D、E、F及組分HA-1、HA-2,分別配制成10mg/mL的樣品液,備用。
1.3 保濕率的測(cè)定[7]
分別配制10mg/mL樣品及甘油溶液。分別稱取3g溶液于稱量皿中,放入硅膠干燥器內(nèi),20℃條件下進(jìn)行保濕實(shí)驗(yàn)。每隔1d將稱量皿取出稱質(zhì)量,連續(xù)稱質(zhì)量6次,由此測(cè)定前后試樣的質(zhì)量差。
式中:mn為放置n天后的含水質(zhì)量;m0為放置前的含水質(zhì)量。
1.4 對(duì)Fe3+的還原能力
采用鐵氰化鉀法[8]測(cè)定。
1.5 對(duì)DPPH自由基的清除能力[9]
樣品液2mL,加2mL DPPH溶液(乙醇配制)搖勻,靜置30min,于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。
式中:A1為樣品液+DPPH溶液的吸光度;A2為樣品液+乙醇溶液的吸光度;A0為DPPH溶液+蒸餾水的吸光度。
1.6 對(duì)·OH的清除能力
參照Smironff等[10]方法并改進(jìn)。取6mmol/L FeSO4溶液2mL,樣品液2mL,6mmol/L H2O2溶液2mL,靜置10min后加入6mmol/L水楊酸溶液2mL,靜置后于波長(zhǎng)510nm處比色??瞻讓?duì)照用蒸餾水代替樣品液,其余不變。
式中:A0為空白對(duì)照的吸光度;A1為某質(zhì)量濃度樣品液的吸光度;A2為無水楊酸時(shí)樣品液的吸光度。
1.7 數(shù)據(jù)處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平行測(cè)定3~5次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)用SPSS(11.5)軟件進(jìn)行單因素方差分析,Duncan,s多重比較分析組間差異顯著性程度,顯著性水平(P<0.05)。
2.1 透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物的保濕性能
保濕作用主要由保濕劑分子對(duì)水分子的作用力引起。透明質(zhì)酸在水溶液中,其分子高度伸展并相互纏繞連接,形成連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),而水分子則在此網(wǎng)絡(luò)內(nèi)通過極性鍵和氫鍵與透明質(zhì)酸分子結(jié)合,使得透明質(zhì)酸就像“分子海綿”一樣,能吸收和保持大量水分。
表1 透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物的保濕作用Table 1 Moisture retention capacity of hyaluronic acid and its degradation products
由表1可見,隨著Mr的增高,透明質(zhì)酸的保濕性逐漸增加;隨時(shí)間的延長(zhǎng),透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物的保濕率下降,但是仍大于甘油的保濕率,1d后透明質(zhì)酸降解產(chǎn)物的保濕率均大于86%,6d后仍維持在35%左右,其中Mr最大的未降解組分HA-2的保濕性最好,1d后保濕率為92.66%,6d后保濕率仍達(dá)48.43%,為甘油的1.55倍,說明透明質(zhì)酸具有良好的保濕性能。方差分析顯示,在相同的保濕時(shí)間內(nèi),降解得到的不同Mr透明質(zhì)酸樣品的保濕性無顯著性差異,但降解樣品與甘油、未降解樣品相比,均存在顯著性差異(P<0.05)。2.2 透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物對(duì)Fe3+的還原能力
Ueda等[11]研究表明,物質(zhì)的還原力與其抗氧化性之間存在聯(lián)系。抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子而清除自由基,還原力越強(qiáng),抗氧化性越強(qiáng)??寡趸瘎┧峁┑碾娮涌梢允笷e3+還原為Fe2+,從而改變反應(yīng)體系的顏色,提高波長(zhǎng)700nm處的吸光度。
表2 透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物對(duì)Fe3+的還原能力Table 2 Ferric ion reducing power of hyaluronic acid and its degradation products
由表2可以看出,各Mr的透明質(zhì)酸均對(duì)Fe3+有一定的還原能力,在0.2~1mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著質(zhì)量濃度的增加,透明質(zhì)酸對(duì)Fe3+的還原能力增強(qiáng)。其中未降解的HA-1、HA-2的還原能力最弱,而樣品A (Mr6000以下)隨著質(zhì)量濃度增加,吸光度增加明顯,還原能力顯著高于其他透明質(zhì)酸樣品。方差分析顯示對(duì)Fe3+的還原能力,HA-1和HA-2之間無顯著性差異,但降解后不同Mr的透明質(zhì)酸之間存在顯著性差異。對(duì)相同Mr的樣品來說,樣品質(zhì)量濃度對(duì)其Fe3+的還原能力均具有顯著性影響。
2.3 透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除作用
表3 透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力Table 3 Scavenging capacity of hyaluronic acid and its degradation products against DPPH free radicals
由表3可見,各Mr的透明質(zhì)酸對(duì)DPPH自由基都具有一定的清除能力,其中樣品A的清除效果最佳,在2mg/mL時(shí)清除率就已達(dá)到83.66%,高于其他Mr段10mg/mL時(shí)的清除率,而樣品B、C和D隨著質(zhì)量濃度增加至6mg/mL清除率趨于平緩,樣品E和F隨著質(zhì)量濃度的增加一直呈上升趨勢(shì),而未降解的HA-1、HA-2組分對(duì)DPPH自由基的清除效果較差,方差分析顯示不同Mr的透明質(zhì)酸對(duì)DPPH自由基的清除能力存在顯著性差異。
對(duì)同一種樣品,隨著質(zhì)量濃度的增加,清除率增強(qiáng),表明透明質(zhì)酸清除DPPH自由基能力呈明顯的量效關(guān)系。方差分析顯示同一種樣品,質(zhì)量濃度對(duì)其清除DPPH自由基能力的影響程度不同,其中樣品A無顯著性差異;樣品B、C、D在質(zhì)量濃度2~6mg/mL之間呈顯著性差異(P<0.05),在質(zhì)量濃度6~10mg/mL之間無顯著性差異;樣品E、F及HA-1、HA-2在各質(zhì)量濃度均呈顯著性差異。
一般認(rèn)為物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除作用與其氫給予能力有關(guān),DPPH自由基能夠接受電子或H·形成穩(wěn)定的反磁性分子[12]。本實(shí)驗(yàn)中Mr最小的樣品A顯示出最強(qiáng)的清除DPPH自由基作用,分子內(nèi)具有更多接受質(zhì)子氫的基團(tuán),可能是因?yàn)楹推渌麡悠废啾扔懈鼜?qiáng)的電子給予能力,這一機(jī)理還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
2.4 透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物對(duì)·OH的清除作用
表4 透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物對(duì)·OH的清除能力Table 4 Scavenging capacity of hyaluronic acid and its degradation products against hydroxyl free radicals
由表4可見,樣品在2~10mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的·OH清除率均有顯著增加趨勢(shì)。但不同Mr樣品特點(diǎn)不同,樣品A和B對(duì)·OH的清除率上升趨勢(shì)呈S型,樣品C、D、E和F隨著質(zhì)量濃度加至6mg/mL趨于穩(wěn)定,而樣品HA-1、HA-2一直呈顯著的梯度上升趨勢(shì),但清除率最高僅達(dá)到50%多,Mr段清除效果較差,但均高于閻欲曉等[13]提取的玉竹多糖對(duì)·OH清除率。
在最低質(zhì)量濃度2mg/mL時(shí)樣品D對(duì)·OH的清除效果最佳,但隨著質(zhì)量濃度的增加,在10mg/mL時(shí)樣品A對(duì)·OH的清除率最高,達(dá)到96.06%。方差分析顯示HA-1和HA-2對(duì)·OH的清除能力無顯著性差異,但不同Mr的降解產(chǎn)物之間存在顯著性差異。同一種樣品,方差分析顯示質(zhì)量濃度對(duì)其·OH清除率的影響程度不同,其中樣品A、B、F及HA-1、HA-2在各個(gè)質(zhì)量濃度均呈顯著性差異;樣品C、D、E在質(zhì)量濃度2~8mg/mL之間呈顯著性差異,而在質(zhì)量濃度8~10mg/mL之間無顯著性差異。
王秋霞等[14]研究了石榴籽丙酮提取物抗氧化活性,其中·OH的最高清除率僅達(dá)到72.41%,低于透明質(zhì)酸的最高清除率。Gordon[15]認(rèn)為還原酮的抗氧化能力是基于其通過給予氫原子從而阻斷自由基鏈的能力而實(shí)現(xiàn)的,還原酮還能夠與過氧化物的前體反應(yīng)阻止過氧化物的形成。在質(zhì)量濃度8~10mg/mL時(shí),低Mr透明質(zhì)酸的還原能力高于高M(jìn)r的透明質(zhì)酸,可能是低Mr透明質(zhì)酸由于分子結(jié)構(gòu)松散,氫鍵作用弱,暴露在外的活性基團(tuán)相對(duì)于結(jié)構(gòu)緊密的高M(jìn)r透明質(zhì)酸要多,因此能夠?qū)⒏嗟淖杂苫D(zhuǎn)變成更穩(wěn)定的物質(zhì),終止自由基的鏈反應(yīng)。
對(duì)魷魚眼透明質(zhì)酸降解,得到不同Mr的透明質(zhì)酸,對(duì)Mr6×103以下、6×103~1×104、1×104~2× 104、5×104~8×104、8×104~1×105、1×105以上及6.77×105、1.73×106透明質(zhì)酸的保濕性和抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同Mr透明質(zhì)酸均具有一定的抗氧化能力,并伴有劑量效應(yīng)關(guān)系,隨著樣品溶液的質(zhì)量濃度增加,抗氧化性也隨之增強(qiáng)。總體上透明質(zhì)酸的抗氧化活性隨著Mr的降低呈增大趨勢(shì);純化后組分HA-1、HA-2對(duì)DPPH自由基的清除率不到20%,抗氧化性較差,而透明質(zhì)酸的降解產(chǎn)物對(duì)Fe3+的還原能力、對(duì)DPPH自由基及·OH的清除能力均較好,說明低Mr透明質(zhì)酸具有較好的抗氧化性,其中Mr6000以下的透明質(zhì)酸抗氧化效果最好;高M(jìn)r的透明質(zhì)酸具有良好的保濕性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)透明質(zhì)酸的抗氧化、抗衰老保健作用和相關(guān)藥物、化妝品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ),但仍需要作進(jìn)一步的體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
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Antioxidant and Moisture Retention Properties of Hyaluronic Acid and Its Degradation Products from Squid Eyes
DAI Qiong,YANG Wen-ge*,CHEN Xiao-fang,ZHAO Yue-yue,XIONG Shu-li, LU Jia-fang
(School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)
Two hyaluronic acid fractions with different relative molecular mass isolated from squid eyes, named as HA-1 and HA-2, respectively and the degradation products of HA-2 separated by ultrafiltration were determined for their moisture retention capacity and antioxidant properties such as ferric ion reducing power and scavenging activity against DPPH and hydroxyl radicals. The results showed that the moisture retention capacity of hyaluronic acid and its degradation products was superior to that of glycerol and increased with increasing relative molecular mass. Fraction HA-2 exhibited the highest water retention rate, 92.66%. All the HA samples investigated possessed antioxidant activity, which increased with decreasing relative molecular mass. Stronger free radical scavenging activity was observed for hyaluronic acid with relative molecular mass below 6000, while HA-1 and HA-2 had weaker antioxidant activity.
hyaluronic acid;relative molecular mass;moisture retention;radical;antioxidant activity
TS254.9
A
1002-6630(2012)01-0035-04
2011-02-28
農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目(2006G-41);浙江省新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目(2008R40G2070044);寧波大學(xué)SRIP重大課題(2009)
代瓊(1989—),女,本科生,研究方向?yàn)楹Q笊镔Y源的綜合利用。E-mail:daiqiong1803@163.com
*通信作者:楊文鴿(1966—),女,教授,博士,研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與高值化利用。E-mail:yangwenge@nbu.edu.cn