蔡其洪，許桂芬，阮麗琴，李春來

（1.莆田學院 醫(yī)學院，福建 莆田 351100；2.食品安全分析與檢測教育部重點實驗室（福州大學），福建 福州 350108）

諾氟沙星（Norfloxacin，NFLX）又名氟哌酸，為第三代喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強，毒副作用低和臨床療效高的特點，是臨床應用最廣泛的喹諾酮類藥物之一.諾氟沙星系化學合成藥物，合成容易，價格低廉，故也是動物和水產養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一，然而由于濫用現(xiàn)象嚴重，導致藥物殘留，給食品安全帶來嚴重的威脅.該類藥物的殘留除其本身的毒副作用對人體造成直接危害外，更為嚴重的是人類長期食用含較低濃度藥物的動物源性食品，容易誘導人類致病菌產生耐藥性，從而影響該類藥物的臨床療效.

目前諾氟沙星的測定方法主要有紫外分光光度［1-2］，高效液相色譜法［3-5］，熒光分析法［6-8］.由于熒光法具有靈敏度高、選擇性好的特點，是應用最廣泛的方法［9］.其中應用Al3＋熒光增敏測定諾氟沙星，并用于滴眼液、膠囊［10］和牛奶［11］中諾氟沙星的測定.而熒光分析法用于肉類食品中諾氟沙星藥物殘留的檢測還未見文獻報道，且本文所建立的熒光法具有更低的檢出限（0.032ng·mL-1），特別適用于痕量藥物殘留的檢測，且樣品前處理方法簡單，用于實際肉類樣品中諾氟沙星含量的測定，所得結果令人滿意.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4600熒光分光光度計（日本日立公司）；超聲清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；萬分之一電子天平（上海恒平科學儀器有限公司）；離心機（上海手術器械廠），PHS-3C酸度計（上海精密科學儀器公司）.

諾氟沙星（中國藥品生物制品檢定所，99.2%），標準溶液質量濃度為100μg·mL-1，Al3＋標準溶液是用 Al（NO3）3（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）配成濃度為0.1mol·L-1，實驗所需的各種肉類食品為市場上隨意購買，其他所用試劑均為分析純，水為純凈水.

1.2 樣品前處理方法

取2g經絞碎的各種肉類食品，每次加入10 mL pH＝4的鹽酸溶液超聲提取三次，每次10 min，各離心10min（3 000r／min），合并三次上清液，加入1mL的Al3＋標準溶液，定容至50mL，待測.

1.3 測定方法

于5mL的具塞刻度試管中配制NFLX-Al3＋的最佳體系溶液，使體系溶液中CAl3＋＝2.0mmol·L-1、pH＝4.0，靜置5min，取試液置于1cm×1cm石英液池中，設置激發(fā)和發(fā)射單色儀狹縫寬度均為5nm，掃描速度為1 200nm·min-1，利用熒光分析法測定.

2 結果與討論

2.1 金屬離子的選擇

許多金屬離子可與諾氟沙星發(fā)生絡合反應，使熒光強度發(fā)生變化.實驗考察了Al3＋、Fe3＋、Fe2＋、Mg2＋、Zn2＋、Cu2＋和 Ni2＋等七種不同金屬離子與諾氟沙星配位反應后熒光強度的變化，結果發(fā)現(xiàn)Al3＋、Fe2＋、Mg2＋和Zn2＋與諾氟沙星配位后熒光強度增強，增強的順序為Al3＋＞Zn2＋＞Fe2＋＞Mg2＋；而 Fe3＋、Cu2＋和 Ni2＋使諾氟沙星的熒光強度受到猝滅.因此，我們選擇Al3＋增強諾氟沙星的熒光強度作為分析測定的條件，其熒光光譜變化如圖1.

圖1 0.1μg·mL-1NFLX和NFLX-Al 3＋的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜Fig.1 Excitation and emission spectra of 0.1μg·mL-1 NFLX and NFLX-Al 3＋

2.2 穩(wěn)定性實驗

實驗考察了NFLX-Al3＋反應體系在24h內熒光強度的變化情況.結果可得從0～5min之內，體系的熒光強度呈遞增狀態(tài)，從5min到24h之間，熒光強度的變化在3%以內，因此實驗選擇NFLX-Al3＋體系反應5min后進行分析測定.

2.3 pH值的影響

諾氟沙星結構中的氧原子和氮原子在不同酸堿溶液中的質子化程度不同，從而影響發(fā)光體系的電子性質以及電子云分布，最后使NFLX-Al3＋體系的熒光性質和強度發(fā)生變化.實驗選擇用1.0mol·L-1鹽酸和氫氧化鈉溶液調節(jié)使NFLX-Al3＋體系中的pH＝0～14，考察在不同pH值溶液中熒光強度的變化，結果如圖2所示，當溶液的pH＝4時，NFLX-Al3＋體系的熒光強度最大.

圖2 不同pH值溶液中體系熒光強度的變化Fig.2 Fluorescence intensity changes in different pH solutions

2.4 Al 3＋濃度的影響

實驗選擇諾氟沙星與不同Al3＋濃度進行反應，測量其熒光強度的變化，結果可得當Al3＋濃度達到2.0mmol·L-1時，體系的熒光強度最大且處于穩(wěn)定，見圖3.故實驗選擇Al3＋濃度為2.0 mmol·L-1作為反應的濃度.

圖3 不同Al 3＋濃度對體系熒光強度的影響Fig.3 lnfluence of the concentration of Al 3＋ on relative fluorescence intensity of NFLX-Al 3＋

2.5 樣品背景干擾情況

肉類樣品的基體復雜，實驗考察了各種肉類樣品基體的干擾情況，從實驗結果可得空白肉類基體主要是內源性蛋白質的干擾，即內源性蛋白質有著較強的熒光強度，但在本實驗選取的最佳條件下熒光峰位置λem＝433nm處測定時，內源性蛋白質的熒光強度可以忽略不計，見圖4.

圖4 0.1μg·mL-1NFLX-Al 3＋（1-1′）和肉類食品（2-2′）的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜Fig.5 Excitation and emission spectra of 0.1μg·mL-1 NFLX-Al 3＋ （1-1′）and meat product（2-2′）

2.6 標準工作曲線和檢出限

梯度配制不同濃度的諾氟沙星標準溶液，在最佳實驗條件下，熒光法分別測定每一種溶液的熒光強度，以λem＝433nm處的熒光強度對諾氟沙星的濃度作工作曲線，見圖5.得諾氟沙星的線性方程為F＝15.89＋36.50C，線性范圍為0.5～250ng·mL-1，相關系數R＝0.999 9，方法的檢出限為0.032ng·mL-1.

2.7 精密度實驗

配制6份相同質量濃度為10ng·mL-1的諾氟沙星溶液，在一定的實驗條件下進行熒光法測定，得諾氟沙星的相對標準偏差（RSD）為2.3%.從實驗所得結果來看，該方法具有很好的精密度.

圖5 諾氟沙星的標準工作曲線Fig.5 Calibration curves of norfloxacin

2.8 加標回收率實驗

分別在不含有諾氟沙星的各種肉類食品中加入不同量的諾氟沙星，設定最佳實驗條件進行測定，每一份樣品平行測定三次，結果取平均值，實驗所得數據見表1所示.

表1 各種樣品中諾氟沙星的回收率Table 1 Recovery of norfloxacin in every samples

3 結 論

實驗采用Al3＋與諾氟沙星配位增強熒光強度，建立了肉類中諾氟沙星藥物殘留的直接熒光分析法.樣品只需通過簡單的處理，不需要分離，即可用于復雜肉類基體中諾氟沙星藥物殘留的痕量測定，且實驗結果具有很好的準確度、靈敏度和選擇性.

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