胡建恩，曹 茜,，楊 帆,，房耀維，王淑軍,*，呂明生，葛 亮，李 瑛

(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005；3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；4.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

耐高溫α-淀粉酶高密度高表達(dá)發(fā)酵條件的優(yōu)化

胡建恩1，曹 茜1,2，楊 帆1,2，房耀維2，王淑軍2,*，呂明生2，葛 亮3，李 瑛4

(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005；3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；4.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)對(duì)產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的重組菌E. coliBL21的高密度高表達(dá)發(fā)酵條件進(jìn)行研究?？疾觳煌囵B(yǎng)基和不同發(fā)酵條件對(duì)該菌株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的影響，并利用正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：在葡萄糖0.5g/L，酵母粉15g/L，pH6.5，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為接種后發(fā)酵4h，誘導(dǎo)時(shí)間為6h，IPTG添加量為0.8mmol/L，接種量為體積分?jǐn)?shù)3%的優(yōu)化條件下，該重組菌發(fā)酵液菌體生物量為原來(lái)的1.29倍，酶活力達(dá)到8.754U/mL，是原來(lái)的1.55倍，目的蛋白的表達(dá)量也為原來(lái)的1.24倍。

耐高溫α-淀粉酶；大腸桿菌BL21；發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵條件

α-淀粉酶作為淀粉酶的一種，是目前一類(lèi)最重要、最古老、應(yīng)用范圍最廣的工業(yè)酶制劑之一，其中耐高α-淀粉酶憑借其熱穩(wěn)定上的優(yōu)勢(shì)經(jīng)占據(jù)很大的市場(chǎng)。用耐高溫α-酶代替普通α-淀粉酶起到推動(dòng)新工藝新技術(shù)的運(yùn)用與研究，降低消耗、降低成本的作用。近年來(lái)，我國(guó)耐高溫α-淀粉酶的產(chǎn)量和出口量逐年增長(zhǎng)，但生產(chǎn)成本愈來(lái)愈高，利潤(rùn)空間日漸趨小[1-3]。因此如何能以最低投入，實(shí)現(xiàn)單位發(fā)酵液的最高目的蛋白表達(dá)量，成為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中研究的重點(diǎn)。

本研究室從海底熱液口獲得了一株超嗜熱古菌Thermococcus siculiHJ21，該菌株分泌的耐高溫α-淀粉酶的最適作用溫度為95℃，在100℃仍有60%的酶活力，酶的最適作用pH5.0，在pH4.5仍有80%的酶活力，酶在90℃的半衰期為5h，在100℃ 作用2h仍有40%的殘余酶活力，酶的熱穩(wěn)定性不依賴Ca2+，比較符合淀粉工業(yè)加工過(guò)程中所需要的條件。對(duì)超嗜熱古菌Thermococcus siculiHJ21α-淀粉酶基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)和定向進(jìn)化研究，獲得了活性、熱穩(wěn)定性提高的突變酶[4-7]。本研究中含有超嗜熱古菌HJ21α-淀粉酶基因的突變基因工程菌產(chǎn)生的耐高α-淀粉酶，不僅具有更高的作用溫度和更低的作用pH值，而且具有比其野生菌更好的熱穩(wěn)定性。本研究以突變的大腸桿菌BL21工程菌為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高其發(fā)酵液耐高溫α-淀粉酶酶活力，降低成本，為該酶工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

含質(zhì)粒pET28-amy的重組E.coli21，淮海工學(xué)院海洋微生物研究室保存。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaC1 10、卡那霉素0.05，pH7.5，卡那霉素與異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)均由0.22μm微孔濾膜法過(guò)濾除菌，其他培養(yǎng)基成分均在121℃滅菌20min。

1.2 培養(yǎng)方法

種子液制備：將活化的菌種以體積分?jǐn)?shù)1%接種量接入含有100mL LB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃、180r/min搖瓶培養(yǎng)12h，作為種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以1%接種量接入裝有100mL LB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在37℃、180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)菌液OD600nm達(dá)到0.5(約4h)時(shí)，再加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為1mmol/L)，誘導(dǎo)4h。測(cè)菌液OD600nm，酶活力及目的蛋白表達(dá)量。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.1 碳源的選擇

以10g/L蛋白胨為氮源，添加5g/L的葡萄糖、甘油、蔗糖、麥芽糖、糊精、可溶性淀粉作為碳源，篩選出最佳碳源。配制碳源0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0g/L和10g/L的不同LB培養(yǎng)基，篩選出最佳碳源的最適質(zhì)量濃度。

1.3.2 氮源的選擇

以最適質(zhì)量濃度的最適碳源為最佳碳源，添加10g/L的蛋白胨、酵母粉、豆餅粉、硫酸銨、硝酸鈉、尿素作為氮源，篩選出最佳氮源。配制氮源5、1 0、15、20、25g/L的培養(yǎng)基，篩選出最佳氮源的最適質(zhì)量濃度。

1.3.3 無(wú)機(jī)鹽的影響

在LB液體培養(yǎng)基中添加KH2PO4和MgSO4無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，添加KH2PO4終質(zhì)量濃度分別為0、1.0、2.0、4.0、8.0、16g/L和32g/L，添加MgSO4使其終質(zhì)量濃度分別為0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2g/L，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，篩選出最佳無(wú)機(jī)鹽添加量。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1 誘導(dǎo)溫度的影響

以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在37℃條件下培養(yǎng)菌液使其OD600nm達(dá)到0.5(約4h)時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為1 mm o l/L)，再分別轉(zhuǎn)移至2 7、3 2、37、4 2、4 7℃的恒溫?fù)u床，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，篩選出最佳誘導(dǎo)溫度。

1.4.2 誘導(dǎo)pH值的影響

以L B培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入下列不同的緩沖液(10mmol/L)[8]，再分別用NaOH調(diào)節(jié)液體LB培養(yǎng)基的pH值：pH5.5～6.0(2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液，MES)，pH6.5～7.0(取代磺酸哌嗪緩沖液，PIPES)，pH7.5～8.0(4-羥乙基呱嗪乙硫磺酸，HEPES)，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，篩選出最佳誘導(dǎo)pH值。

1.4.3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的確定

以L B培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別在接種后培養(yǎng)2、3、4、5、6 h時(shí)加入I P T G進(jìn)行誘導(dǎo)，篩選出最適誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。

1.4.4 誘導(dǎo)時(shí)間的確定

以L B培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別誘導(dǎo)2、4、6、8、10h，篩選出最適誘導(dǎo)時(shí)間。

1.4.5 誘導(dǎo)劑量的確定

以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入IPTG至其終濃度分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mmol/L，篩選出最適誘導(dǎo)劑量。

1.4.6 接種量的確定

以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別按接種體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、2%、3%、4%進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，篩選出最適接種量。

1.4.7 裝液量的確定

以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別按25、50、75、100mL和125mL的裝液量(總體積250mL)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，篩選出最佳裝液量。

1.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

在上述各單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取碳源、氮源、pH值、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG添加量、接種量幾個(gè)主要影響因素，同時(shí)以菌體生物量、酶活力、目的蛋白表達(dá)量為考察指標(biāo)，利用L18(37)正交試驗(yàn)對(duì)以上單因素進(jìn)行優(yōu)化組合試驗(yàn)，篩選出最佳高密度高表達(dá)的試驗(yàn)方法。表1為正交試驗(yàn)水平表。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in orthogonal array design

1.6 分析方法

1.6.1 菌體生物量測(cè)定

測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)期發(fā)酵液在600nm波長(zhǎng)處的光密度值，用O D600nm表示。

1.6.2 酶活力測(cè)定

將發(fā)酵液于10000r/min離心5min，棄去上清液，用50mmol/L、pH7.0磷酸緩沖液重懸菌體，在1280psi(1psi=6.895kPa)條件下超高壓破碎，12000r/min離心10min，收集上清液作為粗酶液。將10μL酶液加入到190μL 1%的可溶性乙酸鈉緩沖溶液(50mmol/L，pH5.0)中，在95℃水浴中反應(yīng)30min，用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定還原糖[9]。酶活力單位定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化產(chǎn)1μmol麥芽糖的酶量為一個(gè)酶活力單位，記為U。

1.6.3 目的蛋白表達(dá)量的測(cè)定

按照1.6.2節(jié)方法制備粗酶液，用考馬斯亮藍(lán)染色法(Bradford法)測(cè)定粗酶液中的總蛋白質(zhì)含量[10]。用15%分離膠和5%濃縮膠對(duì)粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后的凝膠一半用考馬斯亮藍(lán)染色30min后用甲醇-乙酸脫色液脫色，另一半在90℃水浴里反應(yīng)30min后用碘-碘化鉀進(jìn)行染色[11]。用Bandscan分析SDS-PAGE電泳圖[12]，測(cè)定目的蛋白表達(dá)比例，結(jié)合總蛋白含量計(jì)算出目的蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分對(duì)重組菌生長(zhǎng)和目的蛋白表達(dá)的影響

2.1.1 碳源的影響

表2 不同碳源對(duì)菌體生物量和酶活力的影響Table 2 Effect of carbon source on cell density and amylase activity

由表2可知，葡萄糖對(duì)重組大腸桿菌的高密度高表達(dá)發(fā)酵中效果最好，可見(jiàn)，大腸桿菌對(duì)糖類(lèi)的利用，單糖優(yōu)于雙糖，這與普通微生物對(duì)碳源利用的規(guī)律一致[13]。雖然有報(bào)道以甘油代替葡萄糖作為細(xì)菌生長(zhǎng)的碳源可減少代謝抑制物質(zhì)——乙酸的積累，更易達(dá)到重組菌的高密度和外源蛋白的高表達(dá)[14]，但是在本研究中甘油效果仍然不及葡萄糖。如圖1所示，在葡萄糖質(zhì)量濃度為1.0g/L左右時(shí)大腸桿菌菌體生物量和目的產(chǎn)物表達(dá)量都達(dá)到最高。而當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度大于10g/L時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)以及其產(chǎn)物的表達(dá)受到明顯的抑制。

圖1 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)、相對(duì)酶活力及目的蛋白表達(dá)量的影響Fig. 1 Effect of glucose concentration on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

2.1.2 氮源的影響

表3 不同氮源對(duì)菌體生物量和酶活力的影響Table 3 Effect of nitrogen source on cell density and amylase activity

氮源是細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖和酶生產(chǎn)必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，在微生物產(chǎn)酶發(fā)酵中，氮源是必不可少的重要原料。以1g/L的葡萄糖為碳源，考察10g/L的酵母粉、蛋白胨、豆餅粉、尿素、硫酸銨、硝酸鈉對(duì)細(xì)菌高密度高表達(dá)的影響。結(jié)果如表3所示：重組大腸桿BL21在分別以蛋白胨和酵母粉為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，在硫酸銨和硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基中略有生長(zhǎng)，硝酸鈉和尿素不能作為其生長(zhǎng)利用的氮源，因此選取酵母粉作為最適氮源。

圖2 酵母粉質(zhì)量濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)、相對(duì)酶活力及目的蛋白表達(dá)量的影響Fig. 2 Effect of yeast extract concentration on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

如圖2所示，酵母粉質(zhì)量濃度達(dá)到15g/L時(shí)，酶活力和目的蛋白的表達(dá)都較高，隨著酵母粉質(zhì)量濃度逐漸增大，菌體的生長(zhǎng)增長(zhǎng)不明顯，酶活力和目的蛋白表達(dá)量都有所降低?？赡苁怯捎谶^(guò)量的氮源是細(xì)菌的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的速度大于其利用速度，不利于其代謝。因此，酵母粉作為該發(fā)酵中氮源的最適質(zhì)量濃度為15g/L。

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽的影響

2.1.3.1 磷酸鹽的影響

大多數(shù)微生物發(fā)酵，需添加磷酸鹽、鎂、錳、鐵、鉀鹽和氯化物以維持適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度和滲透壓，雖然它們不是作為營(yíng)養(yǎng)物，但有時(shí)對(duì)微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成會(huì)產(chǎn)生重大影響。尤其是無(wú)機(jī)磷酸鹽，會(huì)阻遏次級(jí)代謝物的合成。圖3結(jié)果顯示適量的磷酸鹽促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和目的蛋白的表達(dá)，磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度在2g/L左右時(shí)菌體生物量、酶活和目的蛋白表達(dá)量都達(dá)到最高，因此2g/L的磷酸二氫鉀為最適的磷酸鹽質(zhì)量濃度。

圖3 KH2PO4質(zhì)量濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)、相對(duì)酶活力及目的蛋白表達(dá)量的影響Fig. 3 Effect of KH2PO4 concentration on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

2.1.3.2 硫酸鎂的影響

鎂以離子狀態(tài)存在于菌體中，對(duì)多種酶的活性有促進(jìn)作用。圖4結(jié)果顯示，添加硫酸鎂可促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和目的蛋白的表達(dá)，當(dāng)硫酸鎂質(zhì)量濃度達(dá)到1.0g/L時(shí)，菌體生物量相對(duì)較高，相對(duì)酶活力和目的蛋白都達(dá)到最大，之后隨硫酸鎂質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加菌體濃度雖略有增加，但相對(duì)酶活力與目的蛋白表達(dá)量均下降，綜合考慮適宜的硫酸鎂質(zhì)量濃度為1.0g/L。

圖4 MgSO4質(zhì)量濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)、相對(duì)酶活力及目的蛋白表達(dá)量的影響Fig. 4 Effect of MgSO4 concentration on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

2.2 發(fā)酵條件對(duì)重組菌生長(zhǎng)和目的蛋白表達(dá)的影響

2.2.1 誘導(dǎo)溫度的影響

圖5 溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)、相對(duì)酶活力及目的蛋白表達(dá)量的影響Fig. 5 Effect of cultivation temperature on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

培養(yǎng)溫度是影響細(xì)菌生長(zhǎng)和調(diào)控細(xì)胞代謝的重要因素。如圖5所示，重組大腸桿菌在37℃生長(zhǎng)較好，該溫度也是菌體產(chǎn)酶和目的蛋白表達(dá)較好的溫度，過(guò)高和過(guò)低都不利于菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)。

2.2.2 誘導(dǎo)pH值的影響

微生物在一定的pH值環(huán)境中才能正常生長(zhǎng)繁殖，如果pH值不適，不但妨礙微生物菌體的正常生長(zhǎng)，還會(huì)改變微生物的代謝途徑和代謝產(chǎn)物的性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用加入緩沖液來(lái)保持培養(yǎng)基的pH值，以研究重組菌高密度和高表達(dá)的適宜pH值。如圖6所示，重組菌的生長(zhǎng)適宜pH值為6.0～6.5，該pH值也利于菌株產(chǎn)酶，在pH值為6.5時(shí)目的蛋白表達(dá)量占總蛋白的比例較高，綜合各因素pH值為6.0較好。

圖6 pH值對(duì)重組菌生長(zhǎng)、相對(duì)酶活力及目的蛋白表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of pH on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

2.2.3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響

圖7 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)重組菌生長(zhǎng)、相對(duì)酶活力及目的蛋白表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of induction time point on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

重組大腸桿菌通常在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行誘導(dǎo)，其最佳的誘導(dǎo)起始時(shí)間需要針對(duì)不同的宿主菌及不同的質(zhì)粒體系加以優(yōu)化。如圖7所示，菌體在搖瓶中生長(zhǎng)4h(菌體OD600nm達(dá)到0.5左右)時(shí)，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，相對(duì)酶活達(dá)到最高，目的蛋白得到最大表達(dá)，菌體生物量雖不斷增大，但不利于耐高溫α-淀粉酶的表達(dá)。

2.2.4 誘導(dǎo)時(shí)間的影響

圖8 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌生長(zhǎng)、相對(duì)酶活力及目的蛋白表達(dá)量的影響Fig.8 Effect of induction duration on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

如圖8所示，加入IPTG后分別培養(yǎng)2、4、6、8h和10h。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體濃度逐漸增大。酶活力與目的蛋白表達(dá)量先由迅速升高，而后略有下降趨勢(shì)，分別在4h和6h時(shí)達(dá)到高峰。從經(jīng)濟(jì)角度及IPTG可能存在的副作用方面考慮，認(rèn)為加入IPTG再誘導(dǎo)4h，利于重組菌的生長(zhǎng)和目的蛋白的表達(dá)，4h為最適誘導(dǎo)時(shí)間。

2.2.5 誘導(dǎo)劑添加量的影響

圖 9 IPTG添加量對(duì)重組菌生長(zhǎng)、相對(duì)酶活力及目的蛋白表達(dá)量的影響Fig.9 Effect of IPTG amount on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

誘導(dǎo)劑IPTG在培養(yǎng)基中不被利用，其濃度也比較穩(wěn)定，但選擇不同的誘導(dǎo)濃度對(duì)目的基因的表達(dá)存在較大的影響。如圖9所示，IPTG添加量對(duì)重組菌的產(chǎn)酶活性有一定影響，而對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響不大，高濃度的IPTG對(duì)目的蛋白的表達(dá)不利，添加IPTG適宜的濃度為0.8mmol/L。

2.2.6 接種量的影響

接種量的大小對(duì)發(fā)酵周期的長(zhǎng)短和產(chǎn)酶水平高低的影響較大，接種量過(guò)小則菌體生長(zhǎng)緩慢，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，菌體培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌種活力降低，接種量過(guò)大，雖然縮短了培養(yǎng)時(shí)間，但菌種則容易衰老，酶活力不高，所以選擇合適的接種量對(duì)產(chǎn)酶影響較大[15]。圖10結(jié)果顯示，接種量為2%時(shí)，酶活力和目的蛋白表達(dá)量均達(dá)到達(dá)到最大，隨著接種量的繼續(xù)增加，雖然菌體生物量仍有所上升，但酶活力和目的蛋白表達(dá)量菌呈下降趨勢(shì)，綜合各因素考慮，最佳的接種量為2%。

圖 10 接種量對(duì)重組菌生長(zhǎng)、相對(duì)酶活力及目的蛋白表達(dá)量的影響Fig.10 Effect of inoculum amount on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

2.2.7 裝液量的影響

圖11 裝液量對(duì)重組菌生長(zhǎng)、相對(duì)酶活力及目的蛋白表達(dá)量的影響Fig.11 Effect of medium amount in shake flasks on the growth,amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

培養(yǎng)過(guò)程中裝液量決定了培養(yǎng)瓶中的溶氧量，溶氧濃度是高密度發(fā)酵過(guò)程中影響菌體生長(zhǎng)的重要因素之一。大腸桿菌的生長(zhǎng)代謝過(guò)程需要氧的參與，溶氧量對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成影響很大，溶氧量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響細(xì)菌的代謝。由圖11可見(jiàn)，在50mL/250mL裝液量時(shí)菌體生物量最高，但當(dāng)裝液量達(dá)到75mL/250mL時(shí)，酶活力和目的蛋白的表達(dá)同時(shí)達(dá)到最高，綜合各因素考慮，適宜的裝液量為75mL/250mL。

2.3 培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

如表4所示，根據(jù)極差分析，各因素影響菌體生物量的順序?yàn)镃＞D＞G＞F＞E＞A＞B，最優(yōu)條件組合為A3B2C3D2E1F2G3，其中A、B、E因素影響不大，且當(dāng)取得C3D2F2G3時(shí)發(fā)酵液菌體生物量最大；同理，影響酶活力的主次順序?yàn)镈＞G＞C＞F＞E＞A＞B，最優(yōu)組合為A1B1C3D2E3F2G3，其中B因素影響最小，當(dāng)取得A1C3D2E3F2G3時(shí)發(fā)酵液酶活力最大；以目的蛋白表達(dá)量為考察指標(biāo)，影響其的主次順序?yàn)镚＞C＞D＞A＞B＞F＞E，最優(yōu)組合為A1B2C3D2E1F2G3，其中E因素影響最不顯著，當(dāng)取得A1B2C3D2F2G3時(shí)發(fā)酵液目的蛋白表達(dá)量最大。為獲得高密度、高表達(dá)的發(fā)酵結(jié)果，應(yīng)同時(shí)考慮發(fā)酵液中菌體生物量、酶活力及目的蛋白表達(dá)量與各因素的關(guān)系，綜合以上3個(gè)結(jié)果的組合，最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件為A1B2C3D2E3F2G3，即葡萄糖0.5g/L，酵母粉15g/L，pH6.5，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為接種后發(fā)酵4h，誘導(dǎo)時(shí)間為6h，IPTG添加量為0.8mmol/L，接種量為3%。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，該重組菌發(fā)酵液菌體生物量為原來(lái)的1.29倍，酶活力達(dá)到8.754U/mL，是原來(lái)的1.55倍，目的蛋白的表達(dá)量也為原來(lái)的1.24倍。

表4 培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal array design and results

3 結(jié) 論

通過(guò)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶大腸桿菌重組菌BL21培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，確定了該菌高密度高表達(dá)發(fā)酵方案：葡萄糖0.5g/L酵母粉15g/LpH6.5，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為接種后發(fā)酵4h，誘導(dǎo)時(shí)間為6h，IPTG添加量為0.8mmol/L，接種量為3%。經(jīng)優(yōu)化后，該重組菌發(fā)酵液菌體生物量為原來(lái)的1.29倍，酶活力達(dá)到8.754U/mL，是原來(lái)的1.55倍，目的蛋白的表達(dá)量也為原來(lái)的1.24倍。該研究得到的高密度高表達(dá)的發(fā)酵參數(shù)可為發(fā)酵罐的放大實(shí)驗(yàn)和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

[1] GUPTA R, GIGRAS P, MOHAPATRA H, et al. Microbialα-amylases:a biotechnological perspective[J]. Process Biochemistry, 2003, 38(11):1599-1616.

[2] 劉春莉, 張文學(xué), 楊瑞. 特殊α-淀粉酶的應(yīng)用研究現(xiàn)狀和前景展望[J]. 四川食品與發(fā)酵, 2002, 38(4): 5-9.

[3] 余詩(shī)慶. 耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵活力提高的研究和應(yīng)用[D]. 天津: 天津大學(xué), 2007.

[4] 王淑軍, 陸兆新, 呂明生, 等. 一株深海熱液口超嗜熱古菌的分類(lèi)鑒定及高溫酶活性研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 32(2): 130-136.

[5] 王淑軍, 鄧祥元, 李富超, 等. 耐高溫酸性α-淀粉酶基因部分序列的克隆與分析[J]. 海洋科學(xué), 2007, 31(12): 69-75.

[6] 王淑軍, 陸兆新, 秦松, 等. 超嗜熱古菌耐熱酸性α-淀粉酶的發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 海洋與湖沼, 2009, 40(1): 19-25.

[7] WANG Shujun, LU Zhaoxin, LMingsheng, et a1. Identification of archaeon-producing hyperthermophilicα-amylase and characterization of theα-amylase[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 80(4): 605-614.

[8] JOLIVET E, CORRE E, L’HARIDON S, et al.Thermococcus marinussp. nov. andThermococcus radiotoleranssp. nov., two hyperthermophilic archaea from deep-sea hydrothermal vents that resist ionizing radiation[J]. Extremophiles, 2004, 8(3): 219-227.

[9] 王淑軍. 超嗜熱古菌Thermococcus siculiHJ21高溫酸性α-淀粉酶及其基因克隆的研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[10] 張龍翔, 張庭芳, 李令媛. 生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M]. 2版. 北京: 高等教育出版, 1997: 138-140.

[11] BROWN S H, COSTANTINO H R, KELLY R M. Characterization of amylolytic enzyme activities associated with the hyperthermophilic archaebacteriumPyrococcus furiosus[J]. Appl Environ Microbiol, 1990,56(7): 1985-1991.

[12] 劉旭光, 張杰. 分子生物學(xué)軟件應(yīng)用[M]. 北京: 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2007: 53-54.

[13] 朱偉萍, 張晶. 水處理生物學(xué)[M]. 北京: 中國(guó)電力出版社, 2008: 87-88.

[14] KORZ D J, RINAS U, HELLMUTH K, et al. Simple fed-batch technique for high cell density cultivation ofEscherichia coli[J]. Biotechnol,1995, 39(1): 59-65.

[15] 李進(jìn), 張偉國(guó).L-異亮氨酸產(chǎn)生菌的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué), 2005.

Optimization of Fermentation Conditions for High Cell Density Cultivation and High Hyperthermophilicα-Amylase Expression in RecombinantE. coli

HU Jian-en1，CAO Qian1,2，YANG Fan1,2，F(xiàn)ANG Yao-wei2，WANG Shu-jun2,*，LMing-sheng2，GE Liang3，LI Ying4

(1. College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China；2. School of Marine Science ,Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；3. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；4. School of Biothechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to achieve high-cell-density cultivation and high expression of recombinantE. coliBL21 producing hyperthermophilicα-amylase, the medium composition and shake flask fermentation conditions were optimized using orthogonal array design. The optimal cultivation conditions for the production ofα-amylase were achieved by using a pH 6.5 medium composed of 0.5 g/L glucose and 15 g/L yeast extract and an inoculum size of 3%, and adding 0.8 mmol/L IPTG for 6 h induction after 4 h of fermentation. Under these conditions, the biomass of recombinantE. coliBL21 was increased by 1.29-fold, theα-amylase activity by 1.55-fold (reaching 8.754 U/mL) and the protein expression level by 1.24-fold compared to the preoptimization results.

hyperthermophilicα-amylase；E. coliBL21；cultivation medium；cultivation conditions

O623.54

A

1002-6630(2012)01-0219-07

2011-02-07

江蘇省科技廳農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2008340)；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(09KJA170001)

胡建恩(1962—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樯镔Y源利用。E-mail：huje@dlfu.edu.cn

*通信作者：王淑軍(1965—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸锛捌浠钚晕镔|(zhì)。E-mail：shujunwang86@163.com