謝 勝 梅 妍

（昆明醫(yī)學院附屬昆華醫(yī)院，云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650032）

糖尿病視網膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見最嚴重的慢性并發(fā)癥之一，極具視力威脅。DR 是一種多因素的復雜疾病，其發(fā)病機制經過多年的研究尚未完全明確，近年研究發(fā)現光感受器功能相關基因在糖尿病視網膜病變過程中有所表達，其中色素上皮細胞特異蛋白65（Retina pigment epithelia－specific protein 65，RPE65）突變可導致視網膜中視紫紅質含量降低，相當于視網膜長時間處于暗環(huán)境中［1－4］，從而造成光感受器細胞不能對光發(fā)生反應，到疾病晚期發(fā)生視錐和視桿細胞變性導致嚴重的視力喪失。實驗研究發(fā)現Rpe65 敲除小鼠在生后2～3周即可出現視錐細胞變性，且隨著年齡的增加視桿細胞也逐漸發(fā)生變性［5］。這種視網膜光損傷的易感性是由基因決定的，而Rpe65在其中起重要作用［6］。我們采用實時熒光定量多聚酶鏈反應（RT－PCR）技術，初步分析Rpe65在不同病程糖尿病大鼠視網膜組織上的表達量。

1 材料與方法

1.1 糖尿病動物模型

SD 大鼠32只，雌性，體重：56～460g（昆明醫(yī)學院動物中心提供）。SPF 級GK2 型糖尿病大鼠32只，雌性，體重：98～442g（上海斯萊克實驗動物中心提供）。動物按標準試驗動物要求飼養(yǎng)。按糖尿病病程分為四組，即糖尿病4w 組、8w 組、16w組、24w 組，每組8只。對照組與實驗組周齡相對應分組，每組8只。

1.2 視網膜總RNA提取及純度檢測

取對照組和實驗組各32只大鼠，血糖值范圍分別為5.2～6.7mmol／L（均值5.8mmol／L）和11.8～22.3mmol／L（均值17.9 mmol／L）。3%戊巴比妥按2ml／kg體重腹腔注射深麻醉后取視網膜。用TRIZOL試劑盒，按說明書進行操作提取總RNA。4%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測結果顯示RNA 含量及純度達到試驗要求。

1.3 RT－PCR

分別取正常組、實驗組樣本總RNA 各1ml，設計引物序列Rpe65F和Rpe65R 分別為5′－actgtcctcaccactaac－3′和5′－aggctcagatccaacttc－3′（分子量為106BP），GAPDHF 和GAPDHR 分別為5′－gtgacttcaacagcaactc－3′和5′－gtccagggtttcttactcc－3′，由上海生工公司合成引物。由此逆轉錄生成cDNA，并進行RT－PCR測定。擴增反應完畢后根據融解曲線分析PCR 產物的特異性，由Light Cycler PCR 儀分析其Ct值，并與標準曲線比較得到定量結果。采用相對雙Delta Ct法（DDCT／2－ΔΔCT）進行結果分析，公式：2－ΔΔCT。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。數據以均數±標準差表示，實驗組和對照組測量指標的比較采用獨立樣本t檢驗或配對樣本的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

Rpe65和GAPDH 溶解曲線呈單一峰值，特異性較好，結果可靠；Rpe65和GAPDH 擴增曲線呈S型，擴增效果良好。實驗組與對照組間的平均Ct值具有統(tǒng)計學意義（見表1）。結果表明：RT－PCR 檢測視網膜內Rpe65的表達，與對照組相比，實驗組糖尿病大鼠視網膜中Rpe65 的表達隨周齡的增加呈下降趨勢，即4W＞8W＞16W＞24W。

表1 對照組和實驗組各周齡大鼠的Rpe6表達的定量PCR結果Table 1 The level of Rpe6expression of different aged rats in control and experiment groups

3 討論

Rpe65由Hamel等于1993 年發(fā)現，定位于染色體1p31，是視網膜色素上皮細胞特異性表達、高度保守的蛋白序列。在視網膜色素上皮細胞中大量特異性表達，尤其以視網膜色素上皮細胞微粒體膜表達為主。其含有14 個外顯子，編碼533 個氨基酸，分子量為65KD，被認為是催化全－反－視黃酯轉變成11－順－視黃醇的異構酶之一，后者再經過一系列代謝轉變成視紫紅質，參與光信號的傳導過程［7］。

通常認為糖尿病視網膜病變主要是視網膜微血管病變。然而，越來越多的證據表明，糖尿病視網膜病變出現微血管病變以前，神經視網膜已有病變改變，即視功能損害早于微血管病變發(fā)生。研究顯示，早期糖尿病患者視網膜神經節(jié)細胞和雙極細胞功能就已有異常改變［8］。在眼底血管出現熒光造影異常前就表現出視覺電生理、色覺和視野檢查的異常［9－10］。Kirwin等［11］應用PCR和免疫組化實驗技術顯示，Rpe65在糖尿病4周時表達降低，并隨病程持續(xù)下降至3個月后，證明在糖尿病早期，神經膠質和神經元功能障礙已導致視覺損害。梅妍等［12］實驗結果提示，糖尿病早期，代謝的異常已經對視網膜光感受器的功能產生了影響。光感受器功能相關基因的表達異常有可能是糖尿病早期微血管病變發(fā)生前視力下降、色覺喪失、對比敏感度降低和視網膜電流圖異常的重要原因。電生理研究提示，早期糖尿病患者視網膜神經節(jié)細胞功能就已有異常改變。形態(tài)學研究究也提示，神經視網膜變性先于微血管損害發(fā)生［13－14］。

本實驗通過檢測2 型糖尿病大鼠不同病程中Rpe65的表達量，探討其在2型糖尿病視網膜病變過程中的作用。結果顯示：與正常對照組相比，糖尿病組各期Rpe65表達下降，且隨著病程的延長，表達逐漸降低。表明Rpe65 表達變化與DR 發(fā)生有關，其在視網膜上的表達水平與2型糖尿病模型大鼠的病程呈負相關性。提示糖尿病影響了Rpe65在糖尿病大鼠視網膜上的表達，這種表達的改變可能參與了糖尿視網膜病變的發(fā)生，并且這種表達的改變有可能是糖尿病視網膜病變發(fā)生發(fā)展的促進因素之一，對糖尿病視網膜病變并非僅是微血管病變的觀點起到了一些支持作用，也為進一步探索預防早期糖尿病視網膜病變的進展和開辟治療糖尿病視網膜病變的新途徑提供了一些新的線索。

［1］Rednlond TM，Yu S，Lee E，et al.Rpe65is necessary for production of 11－cis－vitamin A in the retinal visual cycle［J］.Nat Genet，1998，20：344.351.

［2］Hamel CP，Tsilou E，Pfeffer BA，et al.Molecular cloning and expression of RPE65，a novel retinal pig－ment epithelium－specific microsomal protein that is post－transcrip－tionally regulated in vitro［J］.J Biol Chem，2003；268：15751－15757.

［3］Nicoletti A，Wong DJ，Kawase K，et al.Molecular characterization of the human gene encoding an abundant 61kDa protein specific to the retinal pigment epithelium［J］.Hum Mol Genet，2005；4：641－649.

［4］Hamel CP，Tsilou E，Pfeffer BA，et al.A developmentally regulated microsomal protein specific for the pigment epitheliumof the vertebrate retina［J］.J Neurosci Res，2003；34：414－425.

［5］Znoiko SL，Rohrer B，Lu K，et al.Downregulation of conespecific gene expression and degeneration of cone photoreceptors in the rpe65－／－mouse at early ages［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46（4）：1473－1479.

［6］Wenzel A，Reme CE，WIilliams TP，et al.The Rpe65 Leu450Met Variation Increases Retinal Resistance agajnst Lightinduced Degeneration by Slowing Rhodopsin Regeneration［J］.J Neurosci，2001，21：53－58.

［7］Remond TM，Yu S，Lee E，et al.Rpe65is Necessary for Production of 11－cis－vitamin A in the Retinal Visual Cycle［J］.Nat Genet，1998。20：344－351.

［8］Greenstein VC，Holopigian K，Seiple W，et al.Atypical multifocal ERG responses in patients with diseases affecting the photoreceptors［J］.Vision Res，2004，44：2867－2874.

［9］Comi G.Evoked potentials in diabetes mellitus［J］.Clin Neurosci，1997.6：374－379.

［10］Nomura R，Terasaki H，Hirose H，et al.Blue－on yellow perimetry to evaluate S cone sensitivity in diabetics［J］.Ophthalmic Res，2000，23：69－72.

［11］Kirwin SJ，Kanaly ST，Hansen CR，et al.Retinal gene expression and visually evoked behavior in diabetic long evans rats［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci.2011Sep 29；52（10）：7654－63.

［12］梅妍，周鴻鷹，項濤，等.糖尿病大鼠視網膜基因表達譜差異的初步分析［J］.中華醫(yī)學遺傳雜志，2005，22（05）：563－565.

［13］Studholme S.Diabetic retinopathy ［J］.J Perioper Pract，2008，18：205－210.

［14］Emerson MV，Lauer AK.Emerging therapies for the treatment of neovascular age－related macular degeneration and diabeticmacular edema［J］.BioDrugs，2007：21：245－255.