聶建巍，楊蓉婭，叢 林，王文嶺，夏志寬，李海濤

近年來，由于免疫抑制劑以及廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，器官移植、腫瘤的放療、化療以及侵入性治療的增加，播散性毛孢子菌病的報道越來越多[1-3]。隨著唑類和兩性霉素B等抗真菌藥物的大量應(yīng)用，又使真菌耐藥的問題日趨嚴(yán)重，給抗真菌治療帶來新的挑戰(zhàn)[4]。中性粒細胞、單核巨噬細胞以及T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)在抵御病原體的入侵中起著重要的防御作用。其中，單核-巨噬細胞被認為是機體抗感染的主要防線。深部真菌感染與機體免疫防御和免疫狀態(tài)之間有著密切的關(guān)系，而細胞因子在深部真菌感染發(fā)展過程中，起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，因此，免疫調(diào)節(jié)治療近年來也逐漸成為深部真菌感染治療的熱點問題。干擾素-γ （IFN-γ）是輔助性T細胞（Th1細胞）分泌的一種細胞因子，本實驗從細胞及分子水平探討IFN-γ對小鼠巨噬細胞（Macrophage，Mφ）體外抗阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）活性的影響，以此來闡述IFN-γ在抗T.asahii感染中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與菌株

小鼠單核/巨噬細胞系RAW264.7細胞株由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心提供。T. asahii株為北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚病診治中心-80℃保存的T. asahii臨床分離株（編號：BZP07005），經(jīng)API 20CAUX系統(tǒng)生化鑒定及DNA序列分析鑒定證實(AS2.2174)[5]。

1.2 主要試劑

小鼠重組 IFN-γ（PeproTech，1×107U/mg），快速瑞氏-吉姆薩染液（南京建成科技有限公司），胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物工程材料有限公司），胰酶細胞消化液（0.25%Trypsin-EDTA Solution）（碧云天生物技術(shù)有限公司），Trixon-100（sigma公司），細胞培養(yǎng)基采用DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司），NO檢測試劑盒，超氧化物檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 T.asahii傳代、培養(yǎng) 將-80℃保存的T. asahii臨床分離株轉(zhuǎn)種于固體沙氏培養(yǎng)基，傳代3次純培養(yǎng)，挑取一接種環(huán)的T.asahii臨床株接種于液體YPD培養(yǎng)基中，37℃、150r/min搖床培養(yǎng)8h，6000rpm離心，5min收集孢子，PBS(pH7.0)洗滌3次，然后用DMEM高糖培養(yǎng)基進行重懸，用血球計數(shù)板調(diào)整到1×106個 /ml。

1.3.2 Mφ的分離、培養(yǎng) RAW264.7巨噬細胞用DMEM高糖培養(yǎng)基和10%FBS培養(yǎng)3天后，棄培養(yǎng)液，以胰酶-EDTA消化，接種于細胞培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，傳代2次后取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，1000r/min離心5min后，棄上清，用PBS洗2遍，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基懸浮細胞，快速瑞氏-吉姆薩染液染色證實為巨噬細胞，臺盼藍染色計活細胞數(shù)＞95%，計數(shù)、調(diào)整細胞濃度至1×105個/ml。

1.3.3 待測上清液的制備 96孔板，分為實驗組及巨噬細胞對照組。每孔加巨噬細胞懸液100μl，3h后用預(yù)熱的PBS洗2遍，繼續(xù)向?qū)嶒灲M每孔中加入終濃度分別為10、100、1000U/ml的IFN-γ，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，棄舊液，用培養(yǎng)基洗2遍，每孔加T.asahii細胞懸液100μl，培養(yǎng)4h，取上清100μl，轉(zhuǎn)移到另一96孔板，然后置于-80℃冰箱待檢。

1.3.4 不同濃度INF-γ作用后巨噬細胞抗T.asahii活性測定 將上述96孔板剩余的上清液體系中每孔加入2%的TritonX-100 100μl，10min后混勻，從每孔吸出10μl懸液，稀釋100倍后取200μl加到15ml、50℃左右的沙氏培養(yǎng)基中，搖勻，待凝后倒置培養(yǎng)48h，觀察每個平皿的菌落數(shù)，計算每毫升CFU及T.asahii生長抑制率?？瞻讓φ战M不加Mφ及IFN-γ，其余同上[6]。

每毫升T.asahii菌落形成單位(CFU/ml)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)(100)×5；T.asahii生長抑制率=（空白對照組平均CFU/ml-實驗組平均CFU/ml）/空白對照組平均CFU/ml×100%

1.3.5 上清液中亞硝酸根離子（NO2-）的檢測 本實驗參照Ding[7]方法，-80℃冰箱取出待測上清液，恢復(fù)至室溫，用含10%FBS的RPMI1640 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品1mol/L NaNO2溶液，使其濃度分別為0、1、2、5、10、20、40、60、100μmol/L，每孔依次加 GriessⅠ試劑50μl，GriessⅡ試劑50μl，室溫放置10min，在全自動定量繪圖酶標(biāo)儀上550nm波長處測各孔吸收度值。以濃度值(C)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果：A=0.052+0.016C，r2=0.999。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線， 由A值求得相應(yīng)的C值，結(jié)果以μMNO2-/106MΦ表示。

1.3.6 上清液中超氧陰離子（O2-）的檢測 上清液中每孔依次加入終濃度為（10、100、1000U/ml）的IFN-γ，共同孵育18h，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌一次。每孔依次加入超氧化物檢測緩沖液200μl、WST-1溶液10μl，將產(chǎn)生的超氧化物還原成橙色的有色物，Catalase溶液2μl清除過氧化氫等過氧化物對WST-1顯色的干擾，37℃孵育3min，再加入內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）、菌液共同在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育90min后檢測超氧化物陰離子O2-。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗結(jié)果以X ± S表示，采用SPSS 16.0軟件作整體F 檢驗提示方差齊，用單因素方差分析（ANOVA）中的Bonferroni法進行各組均數(shù)間的兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度IFN-γ對RAW264.7細胞抗T.asahii活性的影響（表1）

各實驗組與Mφ對照組比較P＜0.01，結(jié)果表明：隨著lFN-γ濃度的增加，T.asahii生長抑制率增加，其效應(yīng)為劑量依賴性。

表1 Mφ在不同濃度IFN-γ中抗T.asahii的活性

2.2 上清液中亞硝酸根離子(NO2-)檢測結(jié)果(表2)

lFN-γ的濃度分別為 10、100、1000U/ml時，測得上清液中NO2-的濃度，分別為89.16±3.32、108.07±3.81、126.44±3.52，與空白對照組（74.47±1.48）相比組間具有顯著性差異(P＜0.01)。

2.3 上清液中超氧陰離子(O2-)的檢測結(jié)果(表2)

lFN-γ的濃度分別為10、100、1000U/ml時，測得上清液中的O2-分別為0.317±0.006、0. 424±0.006、0.518±0.006，與空白對照組（0. 222±0.008）相比均具有顯著性差異 (P＜0.01)。

表2 不同濃度IFN-γ對巨噬細胞抗T.asahii產(chǎn)生NO及O2-的影響

3 討論

巨噬細胞作為重要的免疫細胞在抵抗感染中起著關(guān)鍵作用，它通過調(diào)理素（特異性抗體、補體、甘露聚糖結(jié)合蛋白）和非調(diào)理素（甘露聚糖受體、葡聚糖受體等）依賴的機制吞噬病原體，并產(chǎn)生多種效應(yīng)分子殺傷病原體。若巨噬細胞不能利用這些機制將病原體吞噬、殺傷，就會使病原體逃逸，造成慢性感染[8]。

IFN-γ生物學(xué)活性廣泛，在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，臨床上用來抗病毒、抗腫瘤、治療過敏性皮炎(AD)、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)[9]、抗肝纖維化[10]等。有研究表明宿主免疫細胞在病原體感染過程中被激活，IFN-γ通過激活Mφ，活化的巨噬細胞在NADPH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）氧化酶的催化作用下將分子氧還原成O2-，在鐵離子的催化下，形成羥自由基，后者與鹵化物反應(yīng)形成活性氧介質(zhì)（reactive oxygen intermediate，ROI）進一步氧化病原體胞膜上的氨基酸，從而殺傷病原體[11]。還有研究表明，Mφ內(nèi)的誘生型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）可利用精氨酸、分子氧及NADPH作為底物催化產(chǎn)生一氧化氮（NO），NO的存在形式不穩(wěn)定，其合成后很快被氧化成NO2-，通常以亞硝酸根的形式存在于細胞外液。NO及其衍生物統(tǒng)稱為活性氮介質(zhì)（reactive nitrogen intermediates，RNI），對多種病原體具有殺傷作用[12]。總之，IFN-γ能激活巨噬細胞并促進其胞內(nèi)殺菌酶活性增強，誘導(dǎo)產(chǎn)生O2-和NO等強烈殺菌物質(zhì)，從而增強機體對病原體的抵抗力[13-15]。

以往的研究提示IFN-γ可增強對煙曲霉、白念珠菌等病原真菌的殺傷作用[16]，Lyman等[17]的研究顯示，IFN-γ預(yù)孵育可明顯增強單核細胞殺傷T.asahii的活性，我們的結(jié)果證實了IFN-γ可明顯增強巨噬細胞抵抗T.asahii感染的活性。本實驗參照Ding[7]方法，用Griess反映測定細胞培養(yǎng)液中的NO2-以反映NO的濃度變化。IFN-γ在( 1～ 1000U/ml)不同濃度組產(chǎn)生NO 的濃度隨著IFN-γ濃度的升高而升高，兩者呈劑量依賴的關(guān)系。T.asahii與1000U/ml的IFN-γ共孵育后，細胞培養(yǎng)上清液中NO的產(chǎn)生明顯增多，Mφ表現(xiàn)出高效的殺傷T.asahii的活性。本實驗研究提示：隨著IFN-γ濃度的升高，T.asahii的生長抑制率增加。IFN-γ增強Mφ殺傷T.asahii的作用機制與NO和O2-產(chǎn)生增多有關(guān)。

[1]楊蓉婭, 敖俊紅, 王文嶺, 等. 阿薩希絲孢酵母引起播散性毛孢子菌病國內(nèi)首例報告 [J].中華皮膚科雜志, 2001,34(5):329-332.

[2]尹秀云, 陳建魁, 高峰, 等. 一例極重度骨髓型急性放射病人合并阿薩絲孢酵母菌感染的實驗鑒定 [J]. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護雜志, 2007, 27(1):32-33.

[3]唐芹芳, 文怡, 梅亞寧, 等. 侵襲性阿薩希毛孢子菌和克柔假絲酵母菌雙重感染1例 [J]. 臨床檢驗雜志, 2008, 26(3):206.4.

[4]Thibeault R, Champagne M, Repentigny Lde, et al. Fatal disseminated Trichosporon asahii infection in a child with acute lymphoblastic leukemia [J]. Can J Infect Dis Med Microbiol,2008, 19(2):203-205.

[5]楊蓉婭, 李天偉, 趙建花, 等.國內(nèi)首例播散性毛孢子菌病病原菌阿薩希絲孢酵母菌的DNA序列分析 [J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志,2001, 81(8):472-475.

[6]Redmond HP, Shou J, Gallagher HJ, etal. Macrophage-dependent candidacidal mechanisms in the murine system.Comparison of murine kupffer cell and peritoneal macrophage candidacidal mechanism [J]. J Immunol, 1993, 150(8Pt 1):3427-3433.

[7]Ding AH, N athan CF, Stueher DJ. Release of reactive nitrogen intermediates and react ive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages [J]. J Immunol, 1988, 141(7):2407-2412.

[8]Roilides E, Katsiardani AA, Georgiadou AD, et al. Suppressive effects of interleukin 10 on human mononuclear phagocyte functi on against Candida albicans and Staphylococcus aureus [J].J Infect Dis, 1998, 178(6):1734-1742.

[9]Stevens SR, Hanifin JM, Hamilton T, et al. Long-term effectiveness and safety of recombinant human interferon gamma therapy for atopic dermatitis despite unchanged serum IgE levels [J]. Arch Dermatol, 1998, 134 (7):799-804.

[10]Baroni GS, D'Ambrosio L, Curto P, et al. Interferon gamma decreases hepatic stellate cell activation and extracellular matrix deposition in rat liver fibrosis [J]. Hepatology, 1996, 23(5):1189-99.

[11]Vazquez G J, Robledo I E, Arroyo A, et al. Acomparison of the antimicrobial resistance patterns of gram-positive cocci isolated from community -private and university-affiliated hospitals from Puerto Rico [J]. PR Health Sci J, 2003, 22(2):131-136.

[12]A ggard E. Nitricoxide: mediator, murderer and medicine [J].Lancet, 1994, 343(8907):1199-1206.

[13]Yoshimasa Yamamoto, Thomas M Klein, Mitsugu Tomioka, et al. Differential effects of Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating factor (GM-CSF) in enhancing macrophage resistance to legionella pneumophila vs Candida albicans [J].Cell Immunol, 1997, 176(1):75-81.

[14]H Paul Rimond, Jian Shou, Hubert J Gallagher, et al.Macrophage-dependent candidacidal mechanisms in the murine system.Compaerison of murine Kupffer cell and peritoneal macrophage candidacidal mechanisms [J]. J Immunol, 1993,150(8Pt 1):3427-3433.

[15]Marodi L, Schreiber S, Anderson DC, et al. Enhancement of macrophage candidacidal activity by interferon-gamma.Increased phagocytosis-killing,and calcium sigal mediated by a decreased number of mannose receptors [J]. J Clin Invest, 1993,91(6):2596-2601.

[16]Gaviria JM, van Burik JA, Dale DC, et al. Comparison of interferon-gamma, granulocyte colony-stimulating factor, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor for priming leukocyte-mediated hyphal damage of opportunistic fungal pathogens [J]. J Infect Dis, 1999, 179(4):1038-1041.

[17]Lyman CA, Garrett KF, Pizzo PA, et al. Response of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes to Trichosporon beigelii: host defense against an emerging opportunistic pathogen [J]. J Infect Dis, 1994, 170(6):1557-1565.