梁 立，張寶貴 ，梁?jiǎn)⑽?，韓藝智 ，史婧賢

（1.天津市寶坻區(qū)苗圃場(chǎng)，天津 寶坻 301800；2.天津市寶坻區(qū)林業(yè)技術(shù)推廣站，天津 寶坻 301800；3.天津市寶坻區(qū)森保站，天津 寶坻 301800）

氮代謝是高等植物最重要的代謝過(guò)程之一，它直接影響樹(shù)體對(duì)氮素的吸收和同化，進(jìn)而影響果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來(lái)，關(guān)于低溫條件下添加鈣素對(duì)細(xì)胞保護(hù)酶活性以及緩解低溫脅迫的研究很多，但有關(guān)鈣對(duì)低溫條件下氮代謝功能影響的研究較少。因此，本試驗(yàn)以北方地區(qū)常用蘋(píng)果砧木山定子為試材，研究低溫條件下鈣對(duì)根系氮代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2009年3～7月進(jìn)行，山定子種子經(jīng)層積催芽后，播種到育苗基質(zhì)中，待長(zhǎng)到5片真葉時(shí)挑選生長(zhǎng)一致的幼苗移入裝有基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽（12 cm×13 cm）中，待根系充滿營(yíng)養(yǎng)缽時(shí)，小心沖洗出根系進(jìn)行水培試驗(yàn)。水培試驗(yàn)于人工氣候箱中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為 25℃（晝）和 15℃（夜），光照強(qiáng)度 400 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間 12 h，相對(duì)濕度70%～80%。處理營(yíng)養(yǎng)液以Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液為基礎(chǔ)（其中鈣濃度為 4 mmol·L-1），設(shè)計(jì) 4個(gè)鈣濃度處理 Ca1、Ca2、Ca3、Ca4，分別添加 4 mmol·L-1、8 mmol·L-1、12 mmol·L-1、16 mmol·L-1硝 酸 鈣[Ca(NO3)2]。各處理分別水培一周后轉(zhuǎn)入低溫處理，處理溫度為10℃（晝）和2℃（夜），以始終處在常溫25℃（晝）和15℃（夜）的植株為對(duì)照，分別于低溫處理3 d后取樣測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，每處理10株，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2 根系活力及氮代謝相關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法

根系活力采用TTC染色法測(cè)定，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，游離氨基酸含量采用茚三酮比色法測(cè)定，游離氨基酸種類(lèi)采用5%磺基水楊酸提取，濾膜過(guò)濾后用日立L8800型氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.3 根系氮代謝關(guān)鍵酶活性測(cè)定方法

硝酸還原酶采用磺胺比色法測(cè)定。取根系0.5 g，加入10 ml磷酸緩沖液，真空充氣10 min，中間放氣2～4次，置于暗室20 min，取出后加入30%三氯乙酸1 ml，立即振蕩，取浸提液2 ml置于試管中，加入1%的磺胺試劑4 ml和0.02%的α-萘胺試劑4 ml，振蕩搖勻靜置 30 min，在540 nm下測(cè)定其吸光度。

按Zhang CF等介紹的方法在根系中提取粗酶液，每克鮮樣加入3 ml提取緩沖液。粗酶液用于 GS、NADH-GOGAT、NADH-GDH 活性測(cè)定。

GS活性參照Rhodes等的方法測(cè)定，一個(gè)GS活性單位定義為該反應(yīng)條件下，每分鐘催化形成1μmol的 γ-谷氨酰異羥肟酸 （γ-glutamy-lhydroxamate）所需要的酶量。NADH-GOGAT活性采用Singh和Srivastava的方法測(cè)定，以每分鐘反應(yīng)混合液于30℃減少1μmol的NADH為一個(gè)酶活性單位?？侼ADH-GOGAT活性計(jì)算以每分鐘每毫克酶液催化NADH減少多少μmol表示。NADH-GDH活性參照Loulakakis和Roubelakis的方法測(cè)定，GDH活性以每分鐘在30℃下氧化1μmol的NADH為一個(gè)酶活性單位。

1.4 呼吸速率的測(cè)定

參照Bouma和毛志泉等的方法進(jìn)行測(cè)定，儀器采用英國(guó)HANSATECH公司生產(chǎn)的液相Oxy-Lab型氧電極。根系測(cè)定時(shí)取直徑1.5 mm左右，長(zhǎng)度約2～3 cm的吸收根，用雙面刀將根切成2 mm左右根段(0.05 g)，迅速稱(chēng)取0.05 g放入反應(yīng)杯，加蓋并啟動(dòng)測(cè)量程序。反應(yīng)杯中反應(yīng)液溫度用恒溫浴控制在25℃，每個(gè)處理3個(gè)(株)重復(fù)。

1.5 呼吸途徑的測(cè)定

參照余讓才和潘瑞熾的方法進(jìn)行測(cè)定。糖酵解途徑(EMP)、三羧酸循環(huán)(TCA)和磷酸戊糖途徑(PPP)分別用 0.5 mol·L-1的 NaF、丙二酸和 Na3PO4抑制，反應(yīng)介質(zhì)為0.2 mol·L-1pH6.8的磷酸緩沖液。每個(gè)途徑測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣對(duì)低溫下山定子根系活力的影響

如圖1所示，低溫使山定子根系活力降低，與常溫對(duì)照差異顯著，添加外源鈣后山定子根系活力有所增加，添加4 mmol·L-1鈣時(shí)根系活力高于對(duì)照，與對(duì)照沒(méi)有顯著差異，添加8 mmol·L-1鈣時(shí)根系活力雖低于常溫對(duì)照，但仍高于低溫對(duì)照，當(dāng)外源鈣濃度增加到 12 mmol·L-1和 16 mmol·L-1時(shí)根系活力降低，與對(duì)照呈顯著差異。

2.2 鈣對(duì)低溫下山定子根系氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

如圖2所示，低溫降低了山定子根系NR活性，但與常溫相比沒(méi)有明顯差異。添加外源鈣能提高根系NR活性，四個(gè)鈣濃度處理根系NR活性均高于低溫對(duì)照和常溫對(duì)照，添加4 mmol·L-1鈣處理與低溫對(duì)照呈顯著差異，但各個(gè)濃度鈣處理與常溫對(duì)照均無(wú)顯著差異。

低溫明顯增加了山定子根系GS活性，與相同處理的常溫對(duì)照呈顯著差異。添加外源鈣與常溫對(duì)照相比均提高了根系GS活性，且增加的幅度與鈣濃度成正比。但添加外源鈣處理與同溫度的對(duì)照相比在低濃度時(shí)降低了根系GS活性，而高濃度時(shí)（16 mmol·L-1）GS 活性略有增加。 添加4 mmol·L-1鈣和 8 mmol·L-1鈣處理與同溫度的對(duì)照呈顯著差異；除添加4 mmol·L-1鈣處理外均與常溫對(duì)照差異顯著。

由圖2可知，低溫顯著降低了山定子根系NADH-GOGAT活性，與相同處理的常溫對(duì)照差異顯著。添加不同濃度外源鈣對(duì)根系NADHGOGAT活性的影響不同，但根系NADH-GOGAT活性均低于常溫對(duì)照；與低溫對(duì)照相比，添加4 mmol·L-1鈣、 添加 12 mmol·L-1鈣和 16 mmol·L-1鈣處理根系NADH-GOGAT活性有所增加，但添加 8 mmol·L-1鈣處理根系 NADH-GOGAT活性降低，添加外源鈣處理與相同溫度的對(duì)照相比均沒(méi)有顯著差異，但添加8 mmol·L-1鈣和添加12 mmol·L-1鈣處理根系NADH-GOGAT活性與常溫對(duì)照差異顯著。

圖1 鈣對(duì)低溫下山定子根系活力的影響

低溫降低了山定子根系NADH-GDH活性，與相同處理的常溫對(duì)照沒(méi)有明顯差異。外源鈣影響根系NADH-GDH活性，添加4 mmol·L-1鈣和添加8 mmol·L-1鈣時(shí)根系NADH-GDH活性高于低溫對(duì)照，但沒(méi)有顯著差異，當(dāng)鈣濃度增加時(shí)根系NADH-GDH活力明顯降低，與其他處理差異顯著。

2.3 鈣對(duì)低溫下山定子根系GS/GDH比值的影響

如圖3所示，低溫和外源鈣均未改變山定子根系氮代謝途徑。低溫后根系GS/GDH比值增加，與常溫對(duì)照差異顯著。外源鈣在低濃度內(nèi)降低了根系GS/GDH比值，與低溫對(duì)照呈顯著差異，而與常溫對(duì)照沒(méi)有明顯差異；但鈣濃度增加后GS/GDH比值迅速增加，與低溫對(duì)照差異顯著。

2.4 鈣對(duì)低溫下山定子根系氮代謝相關(guān)物質(zhì)的影響

由圖4可知，低溫降低了山定子根系可溶性蛋白質(zhì)含量，與常溫對(duì)照呈顯著差異。添加外源鈣處理與相同溫度的對(duì)照相比增加了山定子根系可溶性蛋白質(zhì)含量，其中4 mmol·L-1鈣處理與低溫對(duì)照呈顯著差異，其余處理與低溫對(duì)照沒(méi)有明顯差異。低溫加鈣處理可溶性蛋白質(zhì)含量均低于常溫對(duì)照。

由圖5可知，低溫降低了山定子根系游離脯氨酸含量，但與常溫對(duì)照沒(méi)有顯著差異。添加鈣處理增加了根系游離脯氨酸含量，其中添加4 mmol·L-1鈣處理和 8 mmol·L-1鈣處理與低溫對(duì)照和常溫對(duì)照均差異顯著。

2.5 鈣對(duì)低溫下山定子根系呼吸速率的影響

如圖6所示，低溫降低了山定子根系總呼吸速率，與常溫對(duì)照相比呈顯著差異。外源加鈣處理改變了根系總呼吸速率，4 mmol·L-1鈣處理和8 mmol·L-1鈣處理增加了根系總呼吸速率，與低溫對(duì)照呈顯著差異；而高濃度鈣處理使根系總呼吸速率降低，與低溫對(duì)照沒(méi)有顯著差異，但與常溫對(duì)照差異顯著。

2.6 鈣對(duì)低溫下山定子根系呼吸途徑的影響

圖2 小分子有機(jī)物對(duì)低溫下山定子根系氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

由圖7可知，低溫和外源鈣均未改變山定子根系呼吸途徑，山定子根系呼吸仍然以由EMP進(jìn)入TCA途徑為主。低溫處理后TCA途徑所占比例明顯降低，而EMP途徑所占比例增加，均與對(duì)照呈顯著差異。添加外源鈣素后，EMP途徑所占比例增加，但TCA途徑所占比例有所降低，使EMP途徑明顯高于TCA途徑和PPP途徑所占比例，從而使EMP進(jìn)入TCA和PPP受阻。添加4 mmol·L-1鈣處理、8 mmol·L-1鈣處理和 12 mmol·L-1鈣處理根系PPP途徑所占比例均低于低溫對(duì)照，且 4 mmol·L-1鈣處理和 8 mmol·L-1處理與低溫對(duì)照呈顯著差異。

3 結(jié)論與討論

3.1 鈣對(duì)低溫條件下根系氮代謝的影響

鈣是植物體必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，它對(duì)果樹(shù)氮代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)、抗病性的影響已有廣泛報(bào)道。Juan etal.的研究發(fā)現(xiàn)番茄根系NR、NiR、GS、GOGAT、PEPC 活性隨溶液中鈣濃度的提高而增加。魯翠濤等研究也表明，不同濃度Ca2+培養(yǎng)后，小麥葉片含Ca2+/CaM-PK的激酶活性上升趨勢(shì)與NR、GS活性上升趨勢(shì)一致，但當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到1 mmol·L-1后，酶活性不再持續(xù)升高，說(shuō)明依賴(lài)于Ca2+/CaM-PK的蛋白激酶對(duì)NR和GS具有一定的調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)研究表明，鈣對(duì)低溫的響應(yīng)很敏感，低溫刺激后細(xì)胞中有個(gè)Ca2+濃度迅速升高的過(guò)程，此過(guò)程在時(shí)間、機(jī)制上和冷脅迫感應(yīng)過(guò)程緊密聯(lián)系，因此，人們推測(cè)Ca2+作為第二信使參與了植物低溫信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)Ca2+還參與植物冷馴化應(yīng)答和快速冷耐受反應(yīng)，提高植物對(duì)低溫的抗逆性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加外源鈣對(duì)山定子根系氮代謝的影響因鈣濃度不同而有差異，添加低濃度鈣可以提高低溫下根系活力、NR、NADH-GOGAT和 NADH-GDH活性、可溶性蛋白質(zhì)含量和游離脯氨酸含量，同時(shí)降低根系GS活性和GS/GDH比值，而添加高濃度鈣的結(jié)果與之相反。低濃度鈣對(duì)根系氮代謝活性的影響基本抵消了低溫引起的氮代謝關(guān)鍵酶活性變化，使之接近常溫對(duì)照的水平，對(duì)低溫下根系氮代謝功能有明顯的改善作用，而高濃度鈣處理則表現(xiàn)出對(duì)氮代謝的抑制作用，這與閆童等的研究結(jié)果一致，可能是鈣離子作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)根系起保護(hù)作用，而高濃度鈣可能導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化而引起氮代謝紊亂。

3.2 鈣對(duì)低溫條件下根系呼吸作用的影響

圖3 鈣對(duì)低溫下山定子根系GS/GDH比值的影響

圖4 鈣對(duì)低溫下山定子根系可溶性蛋白的影響

圖5 鈣對(duì)低溫下山定子根系游離脯氨酸的影響

圖6 鈣對(duì)低溫下山定子根系總呼吸速率的影響

圖7 鈣對(duì)低溫下山定子根系呼吸途徑的影響

鈣對(duì)低溫下根系呼吸速率的影響也表現(xiàn)出低促高抑的作用效果。同時(shí)外源鈣處理改變了山定子根系呼吸途徑，從以TCA途徑為主轉(zhuǎn)為以EMP途徑為主，且隨著鈣濃度的提高TCA途徑所占比例不斷降低而PPP途徑所占比例增加。研究表明外源鈣可以提高低氧和淹水脅迫下根系呼吸代謝關(guān)鍵酶活性，但關(guān)于低溫條件下鈣對(duì)呼吸速率和呼吸途徑影響的研究還未見(jiàn)報(bào)道，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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