韓 笑，劉希玲，文正華

（1.天津市種子管理站，天津 300061；2.津南區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，天津 津南 300350；3.天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所，天津 300384）

1 前言

花椰菜為十字花科蕓薹屬甘藍(lán)的一個變種。目前，花椰菜商品種中大多數(shù)是F1雜交種，要使其整齊一致，就必須要求制種親本高度純合、穩(wěn)定。常規(guī)的親本獲得途徑是通過自花授粉和定向選擇，需經(jīng)6～8代，費(fèi)時費(fèi)工，且花椰菜多為自交不親和。運(yùn)用小孢子培養(yǎng)技術(shù)可以快速獲得基因型純合的雙單倍體（DH）植株，加速育種進(jìn)程，將品種培育年限縮短為3～4 a。

花椰菜小孢子的培養(yǎng)最早見于1992年，Duijs等首次報(bào)道了花椰菜小孢子的培養(yǎng)，2003年后我國也相繼有了成功的報(bào)道。但與其它蕓薹屬作物相比,花椰菜游離小孢子培養(yǎng)比較困難。

本研究對花椰菜小孢子進(jìn)行熱激處理，期望提高小孢子胚胎的發(fā)生率，為育種工作服務(wù)。

2 材料與方法

2.1 材料

選擇天津科潤蔬菜研究所溫室內(nèi)花椰菜，于3～4月份取蕾進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 方法

2.2.1 花蕾大小的選擇

選擇不同大小的花蕾，加一滴醋酸洋紅染液，壓片，于顯微鏡下觀察，確定蕾長與小孢子發(fā)育時期的關(guān)系。選擇單核靠邊期小孢子比例較大的花蕾進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.2 培養(yǎng)基配制

小孢子游離與清洗采用B5液體培養(yǎng)基 （表1），蔗糖濃度 13%，pH6.0，高壓蒸汽滅菌 15 min。小孢子培養(yǎng)采用NLN液體培養(yǎng)基（表2），蔗糖濃度13%，pH6.0，先用0.8μm孔徑濾膜抽濾，再在無菌條件下用0.22μm孔徑濾膜抽濾除菌。胚狀體的分化培養(yǎng)基采用MS固體培養(yǎng)基 （表3），蔗糖濃度3%，瓊脂0.7%，1 mg/L 6-BA+0.01NAA+0.02IAA，pH5.8。

表1 B5培養(yǎng)基配方

表2 NLN培養(yǎng)基配方

表3 MS基本培養(yǎng)基配方

2.2.3 小孢子游離

選擇小孢子處于單核靠邊期的花蕾（4.1～5.0 mm）100個，先用75%酒精消毒30 s，再用含2%有效氯的安替福民溶液（次氯酸鈉）表面消毒15 min，無菌水清洗3次，每次5 min。加入B5培養(yǎng)基，輕輕擠破花蕾游離出小孢子，用50μm孔徑的尼龍篩網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)1000 r/min離心3 min，棄上清液，加B5培養(yǎng)基懸浮沉淀，再重復(fù)離心操作兩次。第三次離心后，用NLN-13培養(yǎng)基懸浮，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整小孢子密度至（1～2）×105個/ml。分裝到直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，每皿3 ml，用parafilm封口膜密封培養(yǎng)皿。

2.2.4 游離小孢子培養(yǎng)與胚狀體培養(yǎng)

將培養(yǎng)皿放入32.5℃下黑暗處理24 h，然后轉(zhuǎn)移到25℃下暗培養(yǎng)，2～3 d后觀察統(tǒng)計(jì)胚狀體數(shù)目，出胚率用每個花蕾的胚狀體數(shù)目表示。等胚長到一定大小后，轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基中，在25℃自然光條件下繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)再生植株。

2.2.5 熱激處理對小孢子胚狀體發(fā)生的影響

以花椰菜為實(shí)驗(yàn)材料，用25℃暗培養(yǎng)作為對照，采用32.5℃黑暗處理24 h和48 h；37℃處理24 h和48 h之后轉(zhuǎn)移到25℃下繼續(xù)培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)不同處理小孢子的出胚情況。

3 結(jié)果與分析

高溫?zé)峒ゎA(yù)處理是促進(jìn)細(xì)胞對稱分裂、改變小孢子發(fā)育方向的主要條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表4），在32.5℃下黑暗處理24 h胚狀體的誘導(dǎo)率最高，平均每蕾可達(dá)1.03個，明顯高于32.5℃下黑暗處理48 h；而未經(jīng)高溫的25℃條件下及過高的37℃條件下未觀察到胚狀體的發(fā)生。

表4 不同熱激處理下的小孢子出胚率

4 討論

4.1 熱激處理對小孢子胚狀體發(fā)生的影響

高溫處理是改變小孢子發(fā)育途徑的必要條件，抑制配子體發(fā)育途徑，促使小孢子對稱分裂，向胚狀體方向發(fā)育，促進(jìn)胚狀體的發(fā)生。未經(jīng)熱激處理以及熱激處理溫度太高都不能改變其發(fā)育途徑，不能產(chǎn)生胚狀體。本次研究表明，32.5℃下黑暗處理24 h為最適條件。

4.2 花椰菜小孢子培養(yǎng)現(xiàn)存問題

影響小孢子胚狀體發(fā)生的因素有很多，本次實(shí)驗(yàn)只針對熱激處理進(jìn)行研究，對于取蕾前溫室氣溫、陽光以及植株的生長狀況等條件，由于時間原因都未進(jìn)行研究。其它影響因素還有很多，還有待于進(jìn)一步深入研究探索。

5 結(jié)論

熱激處理是改變小孢子發(fā)育途徑、促進(jìn)胚狀體發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，最適熱激條件為32.5℃下黑暗處理24 h。

［1］顧宏輝,唐桂香,張國慶,等.冬性花椰菜的小孢子胚誘導(dǎo)和植株再生研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào),2004,30(1)∶34-38.

［2］Duijs C,Voorrips R E,Visser D L,etal,Microspore cultureis successful in most crops types of Brassica oleracea L.[J].Euphytica,1992,60∶45-55.

［3］方淑桂,朱朝輝,曾小玲,等.花椰菜游離小孢子培養(yǎng)及影響因子[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,21(2)∶138-142.

［4］陳瑞陽,宋文芹,李秀蘭.植物有絲分裂染色體標(biāo)本制作的新方法[J].植物分類學(xué)報(bào),1979,21(3)∶297-298.