余 櫻 張兆輝 喻志源 王 偉

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Retinoblastoma protein，Rb）及其相關(guān)蛋白（p107，p130）被認(rèn)為是細(xì)胞周期G1／S期轉(zhuǎn)變的“檢驗點”。在應(yīng)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，終末分化的成熟神經(jīng)元保留細(xì)胞周期再活化的能力，嘗試通過“檢驗點”再次進入細(xì)胞周期。有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元暴露在不同的死亡刺激中均能檢測到磷酸化的Rb［1］，提示Rb信號途徑可能在缺血后神經(jīng)元凋亡中起重要作用，但是Rb和神經(jīng)元凋亡的準(zhǔn)確關(guān)系、參與神經(jīng)元凋亡的具體機制仍然不明確。本研究采用離體培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元糖氧剝奪（Oxygen-glucose deprivation，OGD）再給氧實驗，探討OGD誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)磷酸化Rb（phospho-Rb，p-Rb）的表達變化特點及其與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系，嘗試從神經(jīng)元細(xì)胞周期調(diào)控的角度來闡述缺血缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 大鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)

按照Katchanov的方法［2］稍加改進。取24 h內(nèi)新生的SD大鼠大腦皮層，0.125%胰酶-0.02%EDTA37℃消化15 min，1000 r／min室溫離心3 min，棄上清，在含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液中重懸，吹打分散成細(xì)胞懸液，經(jīng)直徑70μm的篩網(wǎng)過濾，以3.5×105／ml的細(xì)胞密度接種于多聚賴氨酸（0.1 mg／ml）包被過的24孔板中，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第2 d更換神經(jīng)元培養(yǎng)基（Neurobasal-A＋2%B27＋0.5 mM L-谷氨酰胺），以后每3 d半量換液一次，選取第7 d的細(xì)胞進行實驗研究。

1.2 糖氧剝奪模型制備

參考Gwag的方法［3］制備OGD模型。將培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元隨機分為對照組、糖氧剝奪1 h后恢復(fù)糖氧供給（OGD／R）6、12、24 h組。OGD／R各組神經(jīng)元加入不含糖Earl’s平衡鹽溶液（EBSS：116.4 mM NaCl，0.8 mM MgSO4，5.4 mM KCl，2.6 mM NaH2PO4，26.2 mM NaHCO3，1.8 mM CaCl2，and 20.1 mM HEPES pH7.4）后放入缺氧培養(yǎng)箱（93%N2，5%CO2，＜2%O2）37℃培養(yǎng)1 h，對照組加入含糖EBSS（EBSS加5.6 mM葡萄糖）放入正常條件培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)1 h。此后，對照組和OGD／R各組神經(jīng)元均換成神經(jīng)元培養(yǎng)基正常條件培養(yǎng)，規(guī)定時間點取出細(xì)胞進行相關(guān)檢測。

1.3 OGD／R各時間點神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白2（Microtubule-associated protein 2，MAP-2）與p-Rb免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記染色

各組細(xì)胞爬片于相應(yīng)時間點去除培養(yǎng)基，PBS漂洗，甲醇室溫固定15 min，0.2%Triton-PBS液中透膜15 min，加封閉液（10%BSA-PBS）室溫封閉2 h，滴加比例稀釋的小鼠抗 MAP-2單克隆抗體（Chemicon，1∶100）和兔抗磷酸化Rb（ser 795）多克隆抗體（Cell Signaling，1∶100）4℃孵育過夜，棄一抗，滴加CY3標(biāo)記羊抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch，1∶200）和FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG（Jackson ImmunoResearch，1∶200）室溫避光孵育40 min，棄二抗，滴加核染料DAPI（5 mg／ml）復(fù)染10 min，流水沖洗后50%甘油封片。

1.4 細(xì)胞凋亡（TUNEL）染色與p-Rb雙標(biāo)記熒光染色

TUNEL染色方法按照試劑盒（Clontech）說明書進行操作。各組細(xì)胞爬片于相應(yīng)時間點固定、透膜，滴加Equilibration Buffer室溫放置10 min，滴加TdT Incubation Buffer混合液濕盒中37℃避光孵育1 h，2×SSC Buffer室溫終止反應(yīng)，滴加上述比例稀釋的兔抗磷酸化Rb（ser 795）多克隆抗體4℃孵育過夜，依次滴加羊抗兔CY3二抗、核染料DAPI孵育，沖洗封片如上述。熒光顯微鏡下觀察、照相。計算隨機不重復(fù)的6個高倍（×400倍）視野下TUNEL或p-Rb陽性細(xì)胞數(shù)或兩者共定位細(xì)胞占DAPI數(shù)量的百分比（n＝3），計算陽性率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，繼以LSD進行兩組間差異性檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 OGD誘導(dǎo)神經(jīng)元 MAP-2與p-Rb表達的特點

對照組 MAP-2在神經(jīng)元胞漿表達，顯示神經(jīng)元胞體呈錐體狀，形態(tài)完整，突起分2～3支，細(xì)長連續(xù)，與相鄰神經(jīng)元突起之間相互連接成網(wǎng)，僅有少數(shù)神經(jīng)元胞核或者胞漿有p-Rb弱表達。OGD／R6 h組觀察到MAP-2顯示神經(jīng)元的突起斷裂不連續(xù)，p－Rb主要在神經(jīng)元胞漿表達，表達率較對照組增多，達到神經(jīng)元總數(shù)的20～30%。OGD／R12 h，神經(jīng)元突起斷裂，相互之間失去連接，網(wǎng)絡(luò)紊亂，此時p－Rb的表達達到高峰，約有40～50%的神經(jīng)元p-Rb在胞漿強表達。OGD／R24 h，約有將近一半的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不完整，破碎零散，p-Rb表達稍有減少。

2.2 OGD誘導(dǎo)神經(jīng)元p-Rb表達與凋亡的關(guān)系

對照組中只有5%～10%的神經(jīng)元p-Rb在胞漿內(nèi)弱表達，極少能與TUNEL染色共定位。OGD／R6 h，p-Rb表達增強，凋亡細(xì)胞數(shù)開始增多，兩者共定位的細(xì)胞比例增高，OGD／R12 h，p-Rb表達達到高峰時，幾乎所有凋亡的細(xì)胞均與p-Rb共定位（圖1）。OGD／R 24 h時雖然p-Rb表達和TUNEL均維持在比較高的水平，但是很少觀察到兩者共定位表達（圖1），提示Rb磷酸化可能參與OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元早期凋亡過程。

3 討 論

圖1 各組神經(jīng)元p-Rb標(biāo)記、TUNEL標(biāo)記和兩者共定位標(biāo)記的細(xì)胞比例

既往認(rèn)為神經(jīng)元為終末分化細(xì)胞，一旦分化完成，就不能再進行分裂增殖。精確調(diào)控細(xì)胞周期進程對于維持神經(jīng)元表型及存活十分關(guān)鍵。大量研究證據(jù)顯示在應(yīng)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，神經(jīng)元保留了細(xì)胞周期再活化的能力，嘗試通過“檢驗點”再次進入細(xì)胞周期［4］。Rb被認(rèn)為是神經(jīng)元細(xì)胞周期再進入和可能引起凋亡的一個“門衛(wèi)”［5］。非磷酸化狀態(tài)的Rb通過與轉(zhuǎn)錄因子E2F1結(jié)合阻滯其相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄而使細(xì)胞停留在G1期，而Rb翻譯后的磷酸化修飾參與神經(jīng)元的細(xì)胞周期誘導(dǎo)［6］。Rb磷酸化導(dǎo)致E2F1／Rb復(fù)合物解離和E2F1釋放，促進細(xì)胞進入S期和凋亡［6］。有報道卒中模型中神經(jīng)元表達磷酸化Rb增加［7，8］，但它參與神經(jīng)元凋亡的具體機制不清楚。Rb磷酸化在腦缺血后神經(jīng)元中表達如何變化，如何參與神經(jīng)元的細(xì)胞周期調(diào)控并導(dǎo)致凋亡？本研究發(fā)現(xiàn)糖氧剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Rb磷酸化表達增加，這些細(xì)胞在損傷早期即發(fā)生凋亡，提示Rb可能通過誘導(dǎo)缺血缺氧神經(jīng)元細(xì)胞周期紊亂參與其早期凋亡過程。

MAP-2是神經(jīng)元的細(xì)胞骨架成分，作為神經(jīng)元的標(biāo)記物，用來觀察OGD／R不同時間點神經(jīng)元細(xì)胞骨架形態(tài)的變化。對照組中，MAP-2存在于神經(jīng)元的胞漿和突起中，相鄰細(xì)胞突起相互交聯(lián)，連接成網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)遭受OGD損傷后，首先觀察到MAP-2標(biāo)記的神經(jīng)元突起斷裂不連續(xù)，接著突起之間失去連接，網(wǎng)絡(luò)紊亂，最后觀察到將近一半的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)欠完整，部分破碎零散，表明OGD1 h后恢復(fù)糖氧供給處理成功地對培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元造成缺血缺氧損傷，為后續(xù)OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞周期改變及凋亡建立有效細(xì)胞模型。

本研究對培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元糖氧剝奪后再恢復(fù)糖氧供給，來誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷。我們的結(jié)果顯示神經(jīng)元OGD處理后，ser 795位點磷酸化的Rb蛋白在早期（6 h和12 h）即表達迅速增加，提示這些神經(jīng)元正常細(xì)胞周期調(diào)控已被打亂，同時，我們觀察到損傷早期大部分發(fā)生Rb磷酸化的神經(jīng)元能與TUNEL染色共定位，說明OGD損傷的大部分神經(jīng)元通過Rb磷酸化導(dǎo)致其原有的細(xì)胞周期紊亂，但是這些神經(jīng)元最終結(jié)局不是增殖而是凋亡。

我們在研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元暴露于OGD處理后，p-Rb表達在復(fù)氧后6 h和12 h顯著增加，OGD／R12 h，p-Rb表達達到高峰時，幾乎所有TUNEL染色細(xì)胞均與p-Rb共定位，但在OGD／R 24 h，雖然p-Rb表達和TUNEL染色細(xì)胞比例均分別維持在比較高的水平，卻很少觀察到兩者共定位表達，提示Rb磷酸化介導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞周期紊亂可能是OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元早期凋亡機制之一。

Rb磷酸化能決定他自身與轉(zhuǎn)錄因子E2F1結(jié)合以及阻止E2F1轉(zhuǎn)錄的能力。Rb的磷酸化調(diào)控細(xì)胞通過G1期限定點并進入S期，是由細(xì)胞周期蛋白（cyclin）D，E，A和對應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）連續(xù)調(diào)節(jié)的過程。正常情況下神經(jīng)元內(nèi)的細(xì)胞周期蛋白是穩(wěn)定而有序的表達，但是當(dāng)神經(jīng)元受到各種損傷刺激后，細(xì)胞周期蛋白被激活并無序紊亂表達，再表達的CDKs使Rb磷酸化并從轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物E2F1／Rb上脫離，啟動E2F1依賴的凋亡蛋白（如p53，caspase家族，Bax等）的表達來誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［9，10］。根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)，E2F能誘導(dǎo)一些凋亡途徑：1）激活b-myb和c-myb基因；2）增加caspase-3，-9，-8和 Apaf-1的表達；3）激活p53和p73，p53和p73激活前凋亡Bcl-2家族成員，釋放線粒體前凋亡蛋白如細(xì)胞色素c等［9］。

總之，我們發(fā)現(xiàn)OGD處理的成熟神經(jīng)元通過Rb磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，并誘導(dǎo)其發(fā)生早期凋亡，推測Rb磷酸化介導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞周期紊亂可能是缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元早期凋亡機制之一。

1 Park DS，Obeidat A，Giovanni A，et al.Cell cycle regulators in neuronal death evoked by excitotoxic stress：Implications for neurodegeneration and its treatment.Neurobiol Aging，2000，21（6）：771-781.

2 Katchanov J，Harms C，Gertz K，et al.Mild cerebral ischemia induces loss of cyclin-dependent kinase inhibitors and activation of cell cycle machinery before delayed neuronal cell death.J Neurosci，2001，21（14）：5045-5053.

3 Gwag BJ，Lobner D，Koh JY，et al.Blockade of glutamate receptors unmasks neuronal apoptosis after oxygen-glucose deprivation in vitro.Neuroscience，1995，68（3）：615-619.

4 Malik B，Currais A，Andres A，et al.Loss of neuronal cell cycle control as a mechanism of neurodegeneration in the presenilin-1 alzheimer＇s disease brain.Cell Cycle，2008，7（5）：637-646.

5 Liu DX，Greene LA.Neuronal apoptosis at the G1／S cell cycle checkpoint.Cell Tissue Res，2001，305（2）：217-228.

6 Dick FA，Dyson N.p-RB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities.Mol Cell，2003，12（3）：639-649.

7 Yu Y，Luo X，Ren QG，et al.The involvement of upregulation and translocation of phospho-rb in early neuronal apoptosis following focal cerebral ischemia in rats.Neurochem Res，2009，34（6）：1113-1119.

8 Lazzerini Denchi E，Helin K.E2F1is crucial for E2F-dependent apoptosis.EMBO Rep，2005，6（7）：661-668.

9 Byrnes KR，F(xiàn)aden AI.Role of cell cycle proteins in cns injury.Neurochem Res，2007，32（10）：1799-1807.

10 Nguyen MD，Mushynski WE，Julien JP.Cycling at the interface between neurodevelopment and neurodegeneration.Cell Death Differ，2002，9（12）：1294-1306.