肖中岳，孫江濤，茹 藝，高社干，王玉峰，馮笑山，王立東

(1.河南科技大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科、河南科技大學腫瘤研究所，河南洛陽471003;2.河南省食管癌重點開放實驗室，河南鄭州450052)

賁門腺癌(gastric cardia adenocinoma，GCA)是指上端胃臨近食管部位發(fā)生的腺癌，自其被認為與胃癌有不同的病理學特征而是一種獨立的疾病以來，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，是增長速度最快的惡性腫瘤之一［1］。與胃竇腸化及Barrett’s食管類似，賁門黏膜腸化被認為是GCA發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)，對賁門腸化的深入研究有助于揭示GCA發(fā)生、發(fā)展的演進過程，從而為GCA的早期診斷提供理論依據(jù)［2］。絨毛蛋白Villin是一種重要的肌動蛋白粘連蛋白，特異性表達于腸道上皮和部分腎上皮細胞的刷裝緣［3］。近期研究［4］結(jié)果顯示Villin蛋白在Barrett’s食管組織中異常表達，是檢測Barrett’s食管的有效指標。但Villin蛋白與賁門腸化及GCA發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚不明確。本研究通過測定Villin蛋白在賁門各級癌前腸化組織及GCA組織中的表達，探討Villin蛋白在賁門腸化中的作用及其與GCA發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 入選組織包括胃鏡活檢及手術(shù)切除的GCA及癌旁腸化組織共128例，均來自中國賁門癌高發(fā)地區(qū)，其中賁門腸化組織25例，男性19例，女性6例，平均年齡(47.5±12.3)歲;賁門腸化伴不典型增生組織48例，男性30例，女性18例，平均年齡(60.4±7.7)歲;GCA組織55例，男性45例，女性10例，平均年齡(59.4±9.3)歲，患者術(shù)前均未接受放療和化療。同時選取該地區(qū)15例胃鏡普查正常賁門組織作為對照。

1.2 主要試劑 Villin蛋白(兔源多克隆抗體，BS-0535R，工作濃度1∶150)一抗、PV9000 S-P試劑盒、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 組織制作 每例組織均經(jīng)850 mL·L－1乙醇固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm續(xù)切4張，第1張行常規(guī)HE染色，第2張做Villin蛋白免疫組織化學染色，另2張備用。

1.4 免疫組織化學染色 嚴格按照PV9000 S-P試劑盒說明進行操作。采用EDTA(pH 8.0)微波熱修復，一抗孵育條件:4℃放置＞15 h。為排除假陽性和假陰性，采用已知陽性片為陽性對照和PBS代替一抗設(shè)為陰性對照。

1.5 結(jié)果判定 Villin蛋白主要表達于腸化上皮細胞的刷狀緣，在GCA組織中呈彌漫性表達。結(jié)果判定采用半定量法。陽性結(jié)果為細胞質(zhì)或細胞核中出現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒，先在低倍鏡下觀察，后隨機讀取5個高倍視野下的陽性細胞數(shù)，將陽性細胞計數(shù)分為4個等級，分別為:無陽性細胞計0分，≤25%計1分，26% ～50%計2分，51% ～75%計3分，＞75%計4分;并將著色強度分為3個等級分別為:無色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。最后將2項評分相乘，得出結(jié)果并分為4個等級:0分為陰性(－)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中度陽性(++)，＞4分為強陽性(+++)。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，定性變量的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，檢驗水準 α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 Villin蛋白在不同賁門組織中的表達 Villlin蛋白在正常賁門組織中無染色;在賁門腸化組織中主要表達于杯狀細胞刷裝緣，染色呈棕黃色;在GCA組織中主要表達于細胞漿中，呈棕黃色。Villin蛋白在正常賁門組織中無陽性表達，在賁門腸化組織中的陽性表達率為76.0%(19/25)，腸化伴不典型增生組織中的陽性表達率為60.4%(29/48)，GCA組織中的陽性表達率為36.4%(20/55)，比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖 1、表1。

2.2 Villin蛋白表達與GCA患者臨床病理學特征的關(guān)系 Villin蛋白表達與GCA患者臨床病理學特征的關(guān)系見表2。

3 討論

賁門腸化在GCA發(fā)生中的作用日益受到重視。Siewert等［5］和 McColl［6］總結(jié)以往的研究后發(fā)現(xiàn)，賁門腸化是GCA的重要癌前病變。由于受到幽門螺桿菌感染和胃食管反流的長期刺激，賁門腸化發(fā)生率極高，從而進一步導致了GCA的高發(fā)生率。而國內(nèi)學者［7］對中國河南賁門癌高發(fā)區(qū)GCA及癌旁組織中腸化情況研究發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)GCA癌旁組織腸化發(fā)生率明顯低于西方國家，但明顯高于該地區(qū)正常人群，提示賁門腸化與GCA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。賁門腸化很可能是GCA的早期病變，對賁門腸化的深入研究有助于揭示GCA發(fā)生、發(fā)展的演進過程，從而為GCA的早期診斷提供理論依據(jù)。

Villin蛋白是一種具有多種功能的鈣離子依賴肌動蛋白粘連蛋白，通常以單體形式出現(xiàn)，相對分子質(zhì)量為 95 000［8－9］，主要表達于小腸絨毛細胞的刷狀緣［3］。Villin蛋白是腸道細胞分化成熟的標志，也是消化道腫瘤的重要腫瘤標志物［10］。趙成波等［11］研究發(fā)現(xiàn)Villin蛋白在胃黏膜腸化組織中出現(xiàn)了異常高表達，Weimann等［12］研究發(fā)現(xiàn)Villin蛋白的異常表達同樣出現(xiàn)在Barrett’s食管組織中，這提示Villin蛋白很可能參與了這些部位腸化的發(fā)生。與之相近，本研究結(jié)果顯示Villin蛋白在正常賁門組織中無表達，而在賁門的癌前腸化組織中出現(xiàn)異常高表達，提示Villin蛋白的異常表達是賁門腸化發(fā)生的重要早期事件。

表1 Villin蛋白在不同賁門組織中的表達 n(%)

表2 Villin蛋白表達與GCA患者臨床病理學特征的關(guān)系 n(%)

Villin蛋白作為重要的細胞結(jié)構(gòu)蛋白，在維持腸上皮表型中發(fā)揮重要作用［13］。有研究［14］發(fā)現(xiàn)，Villin蛋白在腸道腫瘤發(fā)生中出現(xiàn)表達率及表達位置的改變，這些改變受CDX2蛋白的調(diào)控，是導致腸上皮細胞失分化的重要因素。趙成波等［11］的研究結(jié)果也顯示，Villin蛋白在胃腸化組織中的表達明顯低于胃不典型增生及胃癌組織，且在各級不典型增生組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義，提示Villin蛋白在維持胃黏膜腸化上皮結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。本研究中，Villin蛋白在賁門腸化組織、腸化伴不典型增生組織至GCA組織的發(fā)展過程中其陽性表達率逐漸下降，且在該過程中伴有表達位置出現(xiàn)空間和時間上的轉(zhuǎn)變，隨著分化程度的逐步改變，該蛋白表達的位點及強度發(fā)生改變，在賁門腸化組織中Villin蛋白主要表達于杯狀細胞刷狀緣，染色較強，而在腸化伴不典型增生組織及GCA組織中呈彌漫性表達且染色強度也較弱。本研究還發(fā)現(xiàn)Villin蛋白表達有隨腫瘤細胞分化程度的下降而下降的趨勢。以上結(jié)果均提示，在癌變過程中Villin基因發(fā)生了改變，從而導致Villin蛋白表達異常，進而引起賁門腸上皮表型不能維持，細胞失分化，最終導致了GCA的發(fā)生。

綜上所述，Villin蛋白可能參與了賁門腸化和GCA的發(fā)生，并在GCA的細胞分化中起重要作用。Villin蛋白是檢測賁門早期腸化的有效指標，但由于免疫組織化學技術(shù)的有限性，Villin蛋白在GCA發(fā)生中的具體作用仍需進一步深入研究。

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