李自健，楊俊蘭，焦順昌，張 帆，謝文秀，游俊浩

1解放軍第161醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，湖北武漢 430012；2解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；3海軍總醫(yī)院特需醫(yī)療部，北京 100037

惡性腫瘤患者化療后常導(dǎo)致不同程度的血小板減少，以往臨床多采用輸血小板，目前臨床常在化療后使用血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)來(lái)治療[1-8]，但起效較慢[7]。國(guó)外有研究在化療前使用血小板生成素[9]，但目前臨床上對(duì)此有些擔(dān)心，是否會(huì)加重化療藥物對(duì)巨核細(xì)胞的抑制以及是否安全。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察化療藥物卡鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞和使用TPO的巨核細(xì)胞的抑制率比較，模擬臨床上化療前使用TPO化療藥物對(duì)巨核細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的影響，間接了解化療前使用TPO是否安全。

材料和方法

1 主要材料 TPO(沈陽(yáng)三生1ml：15 000U)，卡鉑注射液(齊魯公司10ml：100mg)，天津血研所提供的巨核細(xì)胞株MO7e細(xì)胞、解放軍總醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 把MO7e細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清和濃度20ng/ml的TPO)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453培養(yǎng)在RPMI-1640中(含10%胎牛血清)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3 TPO不同濃度對(duì)MO7e細(xì)胞的影響 取MO7e細(xì)胞，把細(xì)胞濃度調(diào)為2×105/ml，把細(xì)胞分10組，每組5個(gè)復(fù)孔，接種在96孔板中，濃度為每孔2×104/100μl，分別加入0、4、8、16、32、64、128、256、512μg/L濃度的TPO，相同方法重復(fù)接種3個(gè)96孔板，各培養(yǎng)24h、48h、72h，然后每孔加入MTT 20μl，4h后每孔加入100μl二甲基亞砜(DMSO)，使用酶標(biāo)儀于492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(A)，計(jì)算MO7e細(xì)胞增殖率。公式=(實(shí)驗(yàn)組A值-對(duì)照組A值)/對(duì)照組A值×100%，作出增殖曲線，以上實(shí)驗(yàn)全部重復(fù)3次。

4 卡鉑對(duì)加入TPO的MO7e細(xì)胞的抑制率 取MO7e細(xì)胞，洗滌2次，懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清和256ng/ml的TPO)，細(xì)胞濃度調(diào)為2×105/ml。把細(xì)胞分成9組，每組6個(gè)復(fù)孔，濃度為2×104/100μl/孔接種在96孔板中，分別加入0到2 000μg/ml濃度的卡鉑，相同方法重復(fù)接種2個(gè)96孔板，各培養(yǎng)24h和48h后，然后每孔加入MTT 20μl，4h后每孔加入100μl的DMSO，使用酶標(biāo)儀于492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(A)，計(jì)算抑制率。公式=1-(實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A)，作出卡鉑對(duì)MO7e細(xì)胞作用曲線，以上實(shí)驗(yàn)全部重復(fù)3次。

5 卡鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的抑制率 取乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1.5×105/ml，分成7組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，濃度為1.5×104/100μl/孔接種在96孔板中，培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后，1-7組分別加入0到800μg/ml濃度的卡鉑，相同方法重復(fù)接種2個(gè)96孔板，各培養(yǎng)24和48h后，每孔加入MTT 20μl，4h后棄上清，每孔加入150μl的DMSO，使用酶標(biāo)儀于492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(A)，計(jì)算抑制率。作出卡鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞作用曲線，以上全部實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用-x±s表示，用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)，相關(guān)性檢驗(yàn)使用秩和相關(guān)檢驗(yàn)，多組間比較使用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TPO濃度變化對(duì)MO7e細(xì)胞的影響 MO7e細(xì)胞增殖率隨TPO濃度增大而增大，TPO濃度達(dá)到256ng/ml時(shí)，細(xì)胞的增殖率達(dá)到最大，同時(shí)也達(dá)到平臺(tái)期，濃度達(dá)到512ng/ml時(shí)細(xì)胞增殖率不再增大，取256ng/ml為TPO實(shí)驗(yàn)濃度。見(jiàn)圖1。

2 卡鉑對(duì)MO7e細(xì)胞的抑制率 隨著卡鉑濃度增大，對(duì)MO7e細(xì)胞的抑制率也增加，呈正相關(guān)。各實(shí)驗(yàn)組的抑制率與對(duì)照組(卡鉑濃度為0μg/ml)相比P<0.01，同時(shí)作圖求得卡鉑對(duì)MO7e細(xì)胞的IC50，作用24h后IC50=4 000μg/ml，作用48h后IC50=1 600μg/ml，見(jiàn)表1、圖2。

3 卡鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率 隨著卡鉑濃度增大，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率也增大，呈正相關(guān)。各實(shí)驗(yàn)組的抑制率與對(duì)照組(卡鉑濃度為0μg/ml)相比P<0.01，作圖求得卡鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞的IC50，作用 24h后 IC50=400μg/ml，作用 48h后IC50=120μg/ml，見(jiàn)表2、圖3。

4 卡鉑對(duì)MO7e細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的抑制率比較卡鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞的IC50遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)MO7e細(xì)胞的IC50，差異達(dá)10倍左右，表明卡鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)MO7e細(xì)胞的抑制率，見(jiàn)表3。

表1 卡鉑作用24h和48h對(duì)MO7e細(xì)胞抑制率變化Tab 1 Inhibitory effect of CBP on proliferation of MO7e cells at 24 and 48h(-x±s, n=6)

表2 卡鉑作用24h和48h對(duì)乳腺癌細(xì)胞抑制率變化Tab 2 Inhibitory effect of CBP on proliferation of MDAMB-453 cells at 24 and 48h(-x±s, n=5)

表3 卡鉑對(duì)MO7e細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的IC50比較Tab 3 Effect of CBP on IC50 of MO7e cells and MDA-MB-453 cells(μg/ml)

圖1 加入TPO 不同時(shí)間細(xì)胞增殖率的變化Fig 1 Effect of TPO on proliferation rate of MO7e cells at different time points

圖2 卡鉑作用24h和48h對(duì)MO7e細(xì)胞抑制率變化Fig 2 Inhibitory effect of CBP on proliferation rate of MO7e cells at 24 and 48h(-x±s, n=6)

圖3 卡鉑作用24h和48h對(duì)乳腺癌細(xì)胞抑制率變化Fig 3 Inhibitory effect of CBP on proliferation of MDA-MB-453 cells at 24 and 48h(-x±s, n=5)

討 論

本實(shí)驗(yàn)用MO7e巨核細(xì)胞株替代巨核細(xì)胞，MO7e細(xì)胞能表達(dá)血小板特異性的表面標(biāo)志物，其表面有TPO受體c-Mpl，并且其生長(zhǎng)需TPO支持。人類骨髓中巨核細(xì)胞數(shù)量非常少，通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法分離和純化比較困難，并且不易在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，因此MO7e細(xì)胞株替代巨核細(xì)胞，目前是最佳研究TPO對(duì)巨核細(xì)胞影響的替代細(xì)胞[10]。

本實(shí)驗(yàn)觀察到TPO能促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖，呈濃度依賴性，TPO濃度256ng/ml時(shí)達(dá)到平臺(tái)期。通過(guò)卡鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞以及對(duì)加入TPO的巨核細(xì)胞IC50比較，卡鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)加入TPO巨核細(xì)胞的抑制率，提示化療前使用TPO可能是比較安全的。因本實(shí)驗(yàn)是體外實(shí)驗(yàn)，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尚有一定差距，還需進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)。

1 Vadhan-Raj S，Verschraegen CF，Bueso-Ramos C，et al.Recombinant human thrombopoietin attenuates carboplatin-induced severe thrombocytopenia and the need for platelet transfusions in patients with gynecologic cancer［J］. Ann Intern Med，2000，132（5）：364-368.

2 Vadhan-Raj S. Recombinant human thrombopoietin in myelosuppressive chemotherapy［J］. Oncology（Williston Park），2001，15（7 Suppl 8）：35-38.

3 魏燕，陳堅(jiān)，徐周敏.重組人血小板生成素治療實(shí)體腫瘤患者化療后血小板減少的臨床觀察［J］. 中國(guó)癌癥雜志，2009，19（9）：705-707.

4 鞠艷芳，李方，趙宏，等. 重組人血小板生成素治療實(shí)體瘤化療所致血小板減少的臨床觀察［J］. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17（5）：937-938.

5 侯繼院，劉興安，單國(guó)用，等. 重組人血小板生成素治療進(jìn)展期胰腺癌化療后血小板減少的臨床觀察［J］. 臨床薈萃，2011，26（11）：976-977.

6 蔡銳剛，徐兵河，黃鏡. 重組人血小板生成素預(yù)防化療引起血小板減少癥的臨床觀察［J］. 中華腫瘤防治雜志，2009，16（9）：707-709.

7 Schiffer CA，Miller K，Larson RA，et al. A double-blind，placebo-controlled trial of pegylated recombinant human megakaryocyte growth and development factor as an adjunct to induction and consolidation therapy for patients with acute myeloid leukemia［J］. Blood，2000，95（8）：2530-2535.

8 王理?yè)P(yáng)，蒙榮欽，張瑜，等. 重組人血小板生成素治療腫瘤化療后血小板減少的臨床觀察［J］. 華西醫(yī)學(xué)，2010，25（9），1686-1688.

9 Vadhan-Raj S，Patel S，Bueso-Ramos C，et al. Importance of predosing of recombinant human thrombopoietin to reduce chemotherapy-induced early thrombocytopenia［J］. J Clin Oncol，2003，21（16）：3158-3167.

10 Broxmeyer HE，Cooper S，Hague N，et al. Human chemokines：enhancement of specific activity and effects in vitro on normal and leukemic progenitors and a factor-dependent cell line and in vivo in mice［J］. Ann Hematol，1995，71（5）：235-246.