馬 杰，魏 冰，楊 科，崔樹德

(河南省腫瘤醫(yī)院病理科 河南鄭州 450003)

三陰乳腺癌患者缺乏有效的靶向治療，化療是目前唯一的系統(tǒng)治療手段，尤其是以鉑類為基礎(chǔ)的化療［1，2］。Top2A 做為鉑類藥物的靶點，近年來一直為廣大學者所關(guān)注［3，4］。本研究檢測Top2A的基因改變及蛋白表達水平，聯(lián)合Ki-67蛋白表達情況，探討蒽環(huán)類藥物治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 標本來源選擇 2008年1月至2009年9月我院手術(shù)切除或粗針穿刺活檢的47例三陰乳腺癌標本，所有患者術(shù)前均未接受任何治療，標本經(jīng)10%的中性緩沖甲醛固定6～48 h，石蠟包埋，切片2～4 μm，經(jīng) HE染色證實為浸潤性導管癌，用IHC法測定ER，PR，HER-2蛋白表達陽性的標本，HER-2(2+)患者再進一步用FISH法檢測HER-2基因擴增情況。確證研究病例為三陰乳腺癌。

1.2 主要試劑 Top2A、Ki-67鼠抗人單克隆抗體及IHC試劑盒購自上?；蚬?FISH法Top2A基因擴增檢測試劑盒購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 IHC法:采用免疫組化Envision法檢測Top2A、Ki-67蛋白表達，陽性反應(yīng)物為棕黃色顆粒，定位于細胞核。高倍顯微鏡下觀察10個視野，計算百分比。

1.3.2 FISH法:采用FISH法檢測Top2A基因的擴增情況，該方法可將Top2A基因標記為紅色，17號染色體標記為綠色。制片后于熒光顯微鏡下觀察。觀察30個腫瘤細胞，計算Ratio值(Ratio值=30個細胞核中紅信號總數(shù)/30個細胞核中綠信號總數(shù))。Ratio＜1.8為陰性，提示該樣本Top2A無基因擴增;Ratio＞2.2為陽性，提示樣本中Top2A基因擴增。紅信號點成簇擴增，也記為Top2A基因擴增陽性。Ratio在1.8～2.2之間時，增加計數(shù)細胞至100個重新計算，或重做FISH試驗來判斷最終結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，兩變量相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Top2A基因表達與蛋白表達 47例三陰乳腺癌患者中，Top2A基因異常的11例，構(gòu)成比為23%。其中擴增4例，缺失7例。Top2A的擴增多表現(xiàn)為成簇，見圖1。缺失主要表現(xiàn)為17號染色體特異信號呈單一綠色或缺失。IHC法檢測Top2A蛋白發(fā)現(xiàn)47例患者中 ＞10%的陽性病例為 36例，構(gòu)成比76.6%。Top2A的表達部位為細胞核，核內(nèi)見大量棕色顆粒，分布呈簇狀或彌散于核內(nèi)。Top2A基因改變與蛋白陽性表達的總符合率為29.7%。本研究對Top2A蛋白陽性病例(＞10%)進行分組，10%～40%為低表達組，＞40%為高表達組，Top2A基因異常表達率分別為42%和23%。統(tǒng)計結(jié)果顯示:Top2A基因異常的病例與Top2A高表達組具有顯著相關(guān)性(r=0.873，P＜0.005)。其中以擴增病例最為顯著(P＜0.001)，提示Top2A的異常擴增可能引起Top2A蛋白表達上調(diào)。

圖1 FISH法檢測Top2A基因

2.2 Top2A蛋白表達與Ki-67蛋白表達的關(guān)系 Ki-67蛋白表達位于細胞核內(nèi)，分布多為灶性，呈顆粒狀或不均一狀。按分類標準把47例三陰乳腺癌患者劃分為3組，正常組＜14%，低表達組14%～40%，高表達組＞40%(見圖2)。47例患者Ki-67的指數(shù)分別為正常組 17%，低表達組 21%，高表達組 62%。Spearman等級相關(guān)分析，Top2A、Ki-67蛋白表達同為高表達病例16例，占34%。兩者存在顯著相關(guān)，而正常組與低表達組統(tǒng)計顯示無相關(guān)，見表1。

圖2 免疫組化染色檢測Top2A蛋白

表1 Top2A蛋白表達與Ki-67增殖指數(shù)的比較

2.3 Top2A基因改變與Ki-67蛋白表達的關(guān)系FISH技術(shù)檢測47例三陰乳腺癌患者發(fā)現(xiàn)Top2A基因改變類型主要為擴增與缺失，其中擴增4例，缺失7例，構(gòu)成比分別為9%和15%。Top2A基因改變與Ki-67高表達組的符合率為100%。Spearman等級相關(guān)分析擴增與缺失發(fā)現(xiàn)，Top2A基因缺失與Ki-67增殖無相關(guān)性。

3 討論

乳腺癌是一種多因素疾病，其臨床病理分子生物學特征非常豐富，依據(jù)組織病理學特征、基因變異與基因分布可分為不同的亞型，三陰乳腺癌(triple negative breast canler，TNBC)是其中的一種。該類患者轉(zhuǎn)移早，復發(fā)率高，無病生存率(DFS)與總體生存率(OS)低，治療上缺乏有效的靶向治療，化療是目前唯一的系統(tǒng)治療手段。有報道認為，以鉑類為基礎(chǔ)的化療可提高三陰乳腺癌的敏感性［5，6］。

Top2A是一種編碼拓撲異物酶的編碼基因，位于17號染色體，是蒽環(huán)類藥物的作用靶點。近年來，大量文獻報道，Top2A與Her-2基因共表達，由此推測，Top2A與Her-2共表達的患者可以從蒽環(huán)類化療中獲益，而Her-2陰性患者則相反。Gehrmann等［7］的研究發(fā)現(xiàn)，對Her-2陰性但具有Top2A高表達的患者，使用蒽環(huán)類藥物同樣可以從臨床治療中獲益，有些臨床試驗結(jié)果表明，Top2A對蒽環(huán)類藥物的預測作用不依賴于Her-2基因表達，Top2A是否擴增與缺失，與Top2A和RNA表達量有關(guān)。普遍認為Top2A對蒽環(huán)類藥物的預測結(jié)果不一致與Top2A的檢測方法及計算方式有關(guān)。Top2A聯(lián)合其它指標預測蒽環(huán)類藥物的療效是目前研究的熱點之一［8］。

Ki-67蛋白是反映細胞增殖活性的常用指標，它是一種定位于細胞核，半衰期短與增殖相關(guān)的非組蛋白性核蛋白，存在于細胞周期中除Go期以外的所有階段，多項研究表明Ki-67抗原表達可反映腫瘤的細胞增殖活性，與惡性腫瘤的發(fā)展，轉(zhuǎn)移和預后高度相關(guān)。Gualneri等［9-11］研究結(jié)果顯示對三陰患者術(shù)前使用輔助化療，觀察Ki-67具有獨特性的臨床價值，同時認為Ki-67是一種獨立的預測治療敏感性指標。

本研究采用免疫分型方法將乳腺癌患者分類:47例患者中包括basal-like型及TNP-nonbasal型。運用FISH方法確定Top2A是否擴增與缺失。IHC法確定Top2A蛋白表達量與Ki-67比較，結(jié)果顯示在Top2A基因改變患者中(包括擴增與缺失)，Top2A的蛋白表達上調(diào)，統(tǒng)計學顯示有顯著相關(guān)(P＜0.001)，同時該組患者Ki-67增殖大于40，而無Top2A基因改變中，盡管存在由Top2A蛋白的高表達，同時Ki-67高表達，3者之間統(tǒng)計學顯示無相關(guān)性，在Top2A蛋白表達組(＞40%)，Ki-67由大量表達，兩者之間存在相關(guān)性(P＜0.05)。提示Top2A蛋白是否存在引起Ki-67高表達的機制。Top2A的基因擴增或缺失，是否可能引起Top2A蛋白的異常表達。深入工作有待深入研究。

聯(lián)合運用生物學指標預測蒽環(huán)類化療藥物療效歷來被人們所關(guān)注。運用Top2A Ki-67蛋白表達做為指標篩選蒽環(huán)類化療藥物治療優(yōu)勢人群，在高表達組中具有臨床檢測價值，對于低表達組應(yīng)當使用Top2A FISH檢測確證Top2A的基因改變。Top2A的基因異?？赡軐飙h(huán)類藥物的使用，減少患者痛苦提高預測療效具有重要意義。

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