游玉明

(重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶 永川 402160)

山胡椒(Litsea cubeba)，又稱山蒼子、木姜子、山雞椒，為樟科(Lauraceae)木姜子屬多年生落葉小喬木，共有250余種，廣泛分布于亞洲熱帶、亞熱帶及澳洲等地．我國(guó)長(zhǎng)江以南各省是這一資源的生物圈，已發(fā)現(xiàn)近50種［1-2］．山胡椒鮮果中揮發(fā)油含量為4%～8%，其中檸檬醛含量占60%～80%(最高可達(dá)90%)，是合成香料及制藥工業(yè)重要的中間體．除此之外，它還含有甲基庚烯酮、香茅醛、蒎烯、檸烯及松油醇等，是合成紫羅蘭酮系列高級(jí)香料的主要原料，也是食品工業(yè)良好的天然增香劑［3-4］．據(jù)研究，山胡椒揮發(fā)油還具有廣譜抗菌、平喘、抗過(guò)敏及松弛平滑肌等多種作用，被廣泛地用于醫(yī)藥、化工及食品行業(yè)，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景［5-6］．

目前，關(guān)于山胡椒揮發(fā)油成分及抑菌活性的研究均為采用單一的提取方法得到山胡椒揮發(fā)油［7-9］，而對(duì)不同方法提取的山胡椒揮發(fā)油中的菌活性之間是否存在差異還未見(jiàn)報(bào)道．因此，本研究擬比較水蒸汽蒸餾法與同時(shí)蒸餾萃取法所得到的揮發(fā)油對(duì)部分食品污染菌的抑菌效果，并在此基礎(chǔ)上探討其最低抑菌濃度(MIC)及熱穩(wěn)定性，旨在為山胡椒資源的深度利用和開(kāi)發(fā)新型食品防腐劑提供理論依據(jù)．

1 材料與設(shè)備

1．1 材料與試劑

山胡椒購(gòu)自重慶市開(kāi)縣臨江鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);乙醚、無(wú)水亞硫酸鈉(均為分析純)產(chǎn)自成都市科龍化工試劑廠．供試菌種：大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、熒光假單孢菌(P．Fluorescens)、黃曲霉(Penicillium sp．)、黑曲霉(Aspergillus sp．)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，均由西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供．營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌培養(yǎng);馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)用于真菌培養(yǎng)．

1．2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);SPX-250B-II型生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);LDZX-40AL型高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);RE-301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義予華儀器有限公司);蒸餾萃取裝置(南京鑾玉化玻儀器有限公司)．

2 方法

2．1 山胡椒揮發(fā)油的提取與制備

2．1．1 水蒸汽蒸餾法(DDE)

取充分研磨后的山胡椒果實(shí)50 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入500 mL去離子水浸泡1～2 h，按《中華人民共和國(guó)藥典》(2005年版)提取揮發(fā)油，將所得揮發(fā)油加入適量無(wú)水硫酸鈉脫水，得到具有濃郁香氣的淡黃色透明液體，置冰箱中保存待用．

2．1．2 同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)

取研磨后的山胡椒原料50 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入500 mL去離子水浸泡1～2 h，用同時(shí)蒸餾萃取裝置提取4 h，收集得到含有山胡椒揮發(fā)油的乙醚溶液，在40℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醚，然后用無(wú)水硫酸鈉脫水，得到具有濃郁香氣的淡黃色透明液體，置冰箱中保存待用．

2．2 山胡椒揮發(fā)油的抑菌效果研究

吸取100 μL(106～107個(gè)/mL)菌懸液于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上涂布均勻，將經(jīng)干熱滅菌后的濾紙片(直徑6 mm)分別放入2種山胡椒揮發(fā)油中浸泡10 min，用無(wú)菌鑷子取出在山胡椒揮發(fā)油中已浸泡的濾紙片貼在固體平板上，每皿貼3片，同時(shí)作對(duì)照．細(xì)菌37℃培養(yǎng)24 h，酵母和霉菌26℃培養(yǎng)3 d后觀察．測(cè)定濾紙片的抑菌圈直徑，結(jié)果取3次試驗(yàn)的平均值［10］．

2．3 最低抑菌濃度的確定

采用2 倍稀釋法［10-11］，以1%Tween-80 為溶劑，將水蒸汽蒸餾法所得山胡椒揮發(fā)油配制成1、1/2、1/4、l/8、l/16、l/32、1/64、1/128、l/256等不同稀釋度的溶液，取各個(gè)濃度藥液1 mL分別加入到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，再加入經(jīng)滅菌處理并冷卻至55℃左右的9 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(真菌用PDA)，充分混勻后冷卻制成含樣液平板．按前述條件接種培養(yǎng)，觀察結(jié)果，每一濃度梯度做3組平行實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組(菌落正常生長(zhǎng))比較，肉眼可見(jiàn)菌落生長(zhǎng)者為無(wú)抑制作用，以完全沒(méi)有菌落生長(zhǎng)的最小質(zhì)量濃度為其MIC，以1%Tween-80溶液作對(duì)照．

2．4 溫度對(duì)山胡椒揮發(fā)油抑菌效果的影響

將山胡椒揮發(fā)油分別置于80、100、121℃下熱處理15 min后，采用濾紙片瓊脂平板擴(kuò)散法測(cè)定揮發(fā)油的抑菌效果，試驗(yàn)重復(fù)3次．

3 結(jié)果與分析

3．1 山胡椒揮發(fā)油的抑菌效果

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，參考美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)［12］推薦標(biāo)準(zhǔn)(以抑菌圈直徑＞20 mm為極敏，抑菌圈直徑在15～20 mm之間為高敏，抑菌圈直徑在10～14 mm之間為中敏，抑菌圈直徑＜10 mm為低敏，無(wú)抑菌圈為耐藥)，兩種提取方法所制得的揮發(fā)油均對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單孢菌3種菌均表現(xiàn)為極敏，對(duì)釀酒酵母表現(xiàn)為中敏，對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)為低敏，但對(duì)黃曲霉和黑曲霉而言，水蒸汽蒸餾法提取的揮發(fā)油的抑菌活性更強(qiáng)．根據(jù)余伯良等［12］的報(bào)道，山胡椒揮發(fā)油抗霉菌的有效成分其抗菌效力從強(qiáng)到弱依次為檸檬醛、香茅醛、山胡椒油、香葉醇、芳樟醇、甲基庚烯酮，因此水蒸汽蒸餾法提取的揮發(fā)油的抑菌活性更強(qiáng)．這可能是與水蒸汽蒸餾法提取的山胡椒揮發(fā)油中含有更多的檸檬醛及香茅醛等抗真菌成分有關(guān)．

表1 山胡椒揮發(fā)油抑菌效果

3．2 山胡椒揮發(fā)油對(duì)供試菌的MIC

據(jù)表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇研究水蒸汽蒸餾法所得的山胡椒揮發(fā)油的MIC，采用2倍稀釋法進(jìn)行測(cè)定．由表2可知，山胡椒水蒸汽蒸餾法對(duì)不同供試菌具有不同的抑菌效果，對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果最好，MIC為1/256;對(duì)金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌和黑曲霉的MIC均為1/128，而對(duì)釀酒酵母的抑菌能力最弱，其最低抑菌濃度為1/32．

表2 山胡椒水蒸汽蒸餾揮發(fā)油的MIC

3．3 溫度對(duì)山胡椒揮發(fā)油抑菌效果的影響

水蒸汽蒸餾法所得山胡椒揮發(fā)油經(jīng)80、100、120℃處理15 min后，對(duì)各供試菌的抑菌效果見(jiàn)表3．

表3 山胡椒揮發(fā)油經(jīng)80、100、120℃加熱處理后對(duì)各種供試菌的抑菌效果

由表3可以看出，經(jīng)過(guò)不同溫度加熱處理，揮發(fā)油對(duì)7種供試細(xì)菌抑菌效果的影響不大，各處理溫度之間抑菌圈的差異不明顯．因此，可以說(shuō)明水蒸汽蒸餾法所得山胡椒揮發(fā)油的抑菌活性成分具有較好的熱穩(wěn)定性．

4 結(jié)論

水蒸汽蒸餾法和同時(shí)蒸餾萃取法所得山胡椒揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及熒光假單胞菌的抑菌圈在20 mm以上，表現(xiàn)為極敏;對(duì)釀酒酵母的抑菌圈，在10～14 mm之間，表現(xiàn)為中敏;對(duì)大腸桿菌小于10 mm，表現(xiàn)為低敏;但對(duì)黃曲霉和黑曲霉而言，水蒸汽蒸餾法提取的揮發(fā)油的抑菌活性更強(qiáng)，水蒸汽蒸餾法所得揮發(fā)油對(duì)不同食源性微生物的MIC有差異，其中抑制枯草芽孢桿菌的MIC最小，為1/256．水蒸汽蒸餾法所得山胡椒揮發(fā)油具有良好的熱穩(wěn)定性，經(jīng)80、100、120℃處理15 min后，其抑菌活性無(wú)明顯變化．

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