袁凱 王勇 童繼春 袁衛(wèi)東 陳棟

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院胸心外科，江蘇 常州 213003）

缺氧微環(huán)境在肺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）是缺氧微環(huán)境中的關(guān)鍵分子[1]。研究認(rèn)為，HIFs的功能主要是由α亞基決定的[2]。HIF-1α和 HIF-2α是其中兩種亞型，兩者雖然結(jié)構(gòu)相似但功能存在差異。我們先前的研究顯示，HIF-1α和 HIF-2α在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織中廣泛表達(dá)，其中 HIF-2α表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期以及患者預(yù)后關(guān)系密切，相反HIF-1α則無明顯相關(guān)[3－4]。在另 一項(xiàng)研 究中，我 們對人肺 腺癌A549細(xì)胞株成功進(jìn)行了缺氧培養(yǎng)，并在多個缺氧時點(diǎn)進(jìn)行了 HIF－α的檢測。結(jié)果顯示，HIF-1α對于急性缺氧環(huán)境極為敏感，其表達(dá)在4 h即至高峰，而HIF-2α在慢性缺氧環(huán)境有持續(xù)較強(qiáng)表達(dá)[5]。通過該項(xiàng)研究我們認(rèn)識到，HIF-1α和 HIF-2α在缺氧過程調(diào)節(jié)中可能各有側(cè)重，即HIF-1α是急性缺氧期的主要反應(yīng)因子，而HIF-2α則主導(dǎo)慢性缺氧調(diào)節(jié)。NSCLC等實(shí)體腫瘤所在的慢性缺氧環(huán)境中，HIF-2α可能發(fā)揮更大的作用。本研究利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)抑制人肺腺癌細(xì)胞株A549中HIF-2α基因的表達(dá)，觀察A549侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，進(jìn)一步探討 HIF-2α在NSCLC中的生物作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料 A549細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，pGPU6／GFP／Neo質(zhì)粒購于上海GeneP-harma制藥技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)所需各種酶購自Takara公司，鼠抗人HIF-2α單克隆抗體購自Abcam公司，Lipofectamin 2000購自Invitrogen公司，Transwells小室購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD Biosciences公司。

1.2 主要儀器 CY-12C便攜式氧濃度監(jiān)測儀（建德市梅城電化分析儀器廠）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Esco垂直流／水平流超凈工作臺（新加坡Esco公司）；5415D小型高速離心機(jī)、5702R臺式冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Roto-Gene 3000熒光定量PCR儀（澳大利亞Corbett Research公司）；臺式超聲細(xì)胞破碎儀（英國SANYO公司）；酶標(biāo)儀、電泳儀及電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad公司）；KHY100空氣恒溫?fù)u床（上海蘇豪智能系統(tǒng)有限公司）；IX51倒置顯微鏡、BX51熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 A549細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)傳代。實(shí)驗(yàn)分組：空白對照組（僅用轉(zhuǎn)染試劑處理），陰性對照組（轉(zhuǎn)染siRNA陰性質(zhì)粒），HIF-2α-siRNA 組 （轉(zhuǎn) 染 HIF-2α-siRNA 質(zhì)粒）。每組設(shè)3復(fù)孔。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染24 h后鋪板并缺氧培養(yǎng)1～2 d。

1.3.2 靶向抑制HIF-2α的siRNA的設(shè)計(jì)與合成參考siRNA設(shè)計(jì)原則[6]，設(shè)計(jì)4條針對 HIF-2α的siRNA，另設(shè)計(jì)1條無關(guān)序列作為陰性對照。對于每條選定的siRNA序列，設(shè)計(jì)2條編碼該序列的單鏈寡核苷酸（single-strand oligonucleotide，ss oligo）模板，并交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.3 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 將合成的ss oligo退火，與經(jīng)過Bbs I、BamH I雙酶切的質(zhì)粒pGPU6／GFP／Neo連接，熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，37℃過夜培養(yǎng)，堿裂解法快速抽提質(zhì)粒。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 胰酶消化培養(yǎng)A549細(xì)胞并鋪板。轉(zhuǎn)染前將質(zhì)粒DNA及10μL脂質(zhì)體分別加入250μL無血清DMEM培養(yǎng)基中并輕輕混勻，靜置混合。然后將上述混合液加入1.5 mL無血清培養(yǎng)基中，混勻后將其加入漂洗過的細(xì)胞中，輕柔晃動平板使之與細(xì)胞充分接觸。37℃下培養(yǎng)6 h后將其中的培養(yǎng)基吸出棄去，更換新鮮培養(yǎng)基并置于缺氧環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。

1.3.5 轉(zhuǎn)染效果檢測 pGPU6／GFP／Neo載體可表達(dá)GFP綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染后24 h和48 h分別在熒光顯微鏡下觀察5個視野，計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

1.3.6 qRT-PCR 按常規(guī)方法提取樣品總RNA，進(jìn)行實(shí)時定量 PCR 檢測。HIF-2α 正義鏈：5′-GAAAACGAGTCCGAAGCC-3′； 反 義 鏈：5′-CCCAAAACCAGAGCCATT-3′。β-actin 正 義 鏈：5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3′；反義鏈：5′-CAGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。擴(kuò) 增 反 應(yīng)條件為95℃90 s；95℃5 s，58℃30 s，共40個循環(huán)，計(jì)算采用2-ΔΔCT法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 Western-blot及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測蛋白表達(dá) 按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.3.8 Transwell檢測法 取100μL Matrigel稀釋后鋪于Transwell小室，4℃風(fēng)干。胰酶消化貼壁細(xì)胞，重懸細(xì)胞并調(diào)整至密度為1×105個／mL。取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室，在下室內(nèi)加入含胎牛血清的完全培養(yǎng)基，分別缺氧培養(yǎng)24 h和48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室并洗膜，將濾膜用甲醛固定并染色。鏡下計(jì)數(shù)上、下、左、右、中5個隨機(jī)視野細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。對于多組數(shù)據(jù)比較，采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)。組間兩兩比較時，用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。若方差齊，采用LSD檢驗(yàn)；若方差不齊，則用Games-Howell法進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染 HIF-2α-siRNA 后 HIF-2αmRNA 表達(dá)水平的變化 各組細(xì)胞HIF-2αmRNA的表達(dá)水平見表1。單因素方差分析顯示，各組間HIF-2αmRNA表達(dá)水平存在顯著差異（轉(zhuǎn)染后24 h：F＝26.13，P＜0.01；轉(zhuǎn)染后 48 h：F＝46.32，P＜0.01）。與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染后缺氧培養(yǎng)24 h和48 h，HIF-2α-siRNA 組 HIF-2αmRNA 表達(dá)水平均下降。在轉(zhuǎn)染后24 h，4條 HIF-2α-siRNA對HIF-2αmRNA的抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在 HIF-2α-siRNA 各組間兩兩比較顯示，HIF-2α-siRNA-4組在轉(zhuǎn)染后兩個時點(diǎn)HIF-2α mRNA表達(dá)水平低于其他3組（P＜0.01）。陰性對照組HIF-2αmRNA雖略有下降，但與空白對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 A549細(xì)胞中 HIF-2α-siRNA對 HIF-2αmRNA表達(dá)的抑制作用

2.2 轉(zhuǎn)染 HIF-2α-siRNA后 HIF-2α蛋白表達(dá)水平的變化 Western blot法檢測HIF-2α蛋白表達(dá)，結(jié)果見表2及圖1。單因素方差分析顯示，各組蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（轉(zhuǎn)染后24 h：F＝16.80，P＜0.01；轉(zhuǎn)染后48 h：F＝223.69，P＜0.01）。組間兩兩比較顯示，與空白對照組相比，HIF-2α-siRNA-1組在兩個時點(diǎn)蛋白表達(dá)均無顯著改變（P＞0.05）；HIF-2α-siRNA-2組在轉(zhuǎn)染后48h與空白對照組相比，蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；HIF-2α-siRNA-3、4組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后兩個時點(diǎn)與空白對照組的HIF-2α蛋白表達(dá)水平相比均有顯著下調(diào)（P＜0.01），而 HIF-2αsiRNA-4相較于 HIF-2α-siRNA-3組，在轉(zhuǎn)染后48 h其HIF-2α蛋白水平更低（P＜0.01）。陰性對照組與空白對照組相比，在兩個時點(diǎn)其HIF-2α蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染 HIF-2α-siRNA-4重組質(zhì)粒的A549細(xì)胞中HIF-2α蛋白下調(diào)最為顯著，且在轉(zhuǎn)染后48h抑制效果最好。

表2 A549細(xì)胞中HIF-2α-siRNA對HIF-2α蛋白表達(dá)的抑制作用

圖1 各組細(xì)胞中HIF-2α蛋白的Western blot分析

2.3 HIF-2α-siRNA對 A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響Transwell小室法結(jié)果如表3及圖2所示。方差分析顯示，各組穿膜細(xì)胞數(shù)存在顯著差異（24 h：F＝2471.37，P＜0.01；48 h：F＝191.24，P＜0.01）。兩兩比較顯示，與空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)組在缺氧培養(yǎng)兩個時點(diǎn)其穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。陰性對照組與空白對照組相比，穿膜細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組的穿膜細(xì)胞數(shù)

圖2 Transwell法測定各組細(xì)胞的侵襲力

2.4 ELISA法檢測各組細(xì)胞VEGF表達(dá)水平 本研究采用ELISA法檢測各組細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)24 h和48 h后血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如表4所示。方差分析顯示，各組間VEGF蛋白表達(dá)水平有顯著差異（24 h：F＝26.37，P＜0.01；48 h：F＝203.30，P＜0.01）。兩兩比較顯示，與空白對照組相比，HIF-2α-siRNA組VEGF蛋白水平在轉(zhuǎn)染后兩個時點(diǎn)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）?？瞻讓φ战M與陰性對照組之間VEGF蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組VEGF蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種進(jìn)化過程中高度保守的抵御外來基因或病毒侵犯的防御機(jī)制。siRNA是RNA干擾作用賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。siRNA是一類長21～25個核苷酸的特殊dsRNA分子，siRNA的序列與所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA兩條單鏈末端為5′端磷酸和3′端羥基；每條單鏈的3′端均有2～3個突出的非配對的堿基。研究表明，RNAi的作用機(jī)制包括起始階段、效應(yīng)階段及反應(yīng)擴(kuò)大階段。RNAi作為基因阻斷技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、高效性的優(yōu)點(diǎn)。用RNAi技術(shù)來抑制目標(biāo)基因的異常表達(dá)，為治療癌癥、遺傳病等疾病開辟了新的途徑。

本研究構(gòu)建了4條針對HIF-2α的siRNA序列發(fā)現(xiàn) HIF-2α-siRNA-4對 HIF-2α的抑制效果最為明顯，在轉(zhuǎn)染后24 h和48 h HIF-2αmRNA表達(dá)相較于空白組下調(diào)了（60.63±5.10）%和（80.00±3.55）%；相應(yīng)在蛋白水平分別下調(diào)了（31.69±11.56）%和（82.87±4.09）%。Transwell試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIF-2αsiRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于兩對照組（P＜0.01），提示HIF-2α與A549細(xì)胞侵襲力有密切關(guān)系。

目前，關(guān)于HIF-1α和VEGF的關(guān)系研究較多且較深入，而對HIF-2α與VEGF的關(guān)系則研究較少。在 Wu等[3]的研究中，發(fā)現(xiàn) VEGF的表達(dá)與 HIF-2α的蛋白表達(dá)密切相關(guān)。本研究采用siRNA技術(shù)抑制HIF-2α表達(dá)后，同樣觀察到在轉(zhuǎn)染后24h和48h，VEGF表達(dá)較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。綜上所述，HIF-2α有望作為靶點(diǎn)應(yīng)用于NSCLC的治療。

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