張長禹， 孟建玉， 周麗君， 桑 文， 雷朝亮＊

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省煙草科學(xué)研究所，貴陽 550081；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北省昆蟲資源利用與害蟲可持續(xù)治理重點實驗室，武漢 430070）

紫外（ultraviolet，UV）光是自然界中主要的非生物脅迫之一，能對多種生物體造成影響［1－2］。UV照射會誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的光敏物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，使生物體內(nèi)的活性氧過量產(chǎn)生，而活性氧會對核酸、膜脂及蛋白質(zhì)等生物大分子造成氧化損傷［3－4］。這些損傷最終會對機(jī)體產(chǎn)生顯著的生物效應(yīng)，包括毒素的產(chǎn)生、突變、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變等［5］。目前，已有大量研究報道UV照射對昆蟲的影響，包括行為學(xué)［6－7］、發(fā)育 生 理 學(xué)［8－9］及 生 物 化 學(xué) 等 方 面［10－13］。 近來的研究表明，UV照射會使昆蟲體內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧，從而對昆蟲造成氧化脅迫，UV對昆蟲而言是一種光脅迫因子［10－13］。

保幼激素（juvenile hormone，JH）是一種由咽側(cè)體合成并分泌到血淋巴的半萜烯類活性物質(zhì)，在生物體內(nèi)以微量的形式存在，處于不斷合成與降解的動態(tài)過程。已發(fā)現(xiàn)的天然保幼激素有7種，分別是JH0、JHⅠ、JHⅡ、JHⅢ、4－methyl－JHⅠ、JH Ⅲ－bisepoxide和methyl farnesoate。保幼激素能抑制成蟲器官芽的生長和分化，促進(jìn)生殖細(xì)胞分化、卵黃發(fā)生、附腺發(fā)育，以及啟動生殖相關(guān)的代謝過程，并參與調(diào)控滯育的發(fā)生與解除，是昆蟲體內(nèi)最重要的激素之一［14－16］。

目前，國內(nèi)外關(guān)于UV脅迫對昆蟲的影響的研究主要集中于昆蟲的行為反應(yīng)、抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)機(jī)制［10－13］上，而 UV 對昆蟲體內(nèi)激素的影響尚未見報道。棉鈴蟲［Helicoverpa armigera（Hübner）］是一種典型的夜行昆蟲，對 UV 光源十分敏感［17－18］。作者前期研究發(fā)現(xiàn)UV照射能對棉鈴蟲造成環(huán)境脅迫，影響其體內(nèi)酶系、蛋白質(zhì)組及生殖力等，保幼激素在昆蟲體內(nèi)具有重要的生理功能，但UV對昆蟲體內(nèi)保幼激素的影響尚不清楚。因此，本研究以棉鈴蟲為試驗材料，模擬昆蟲趨光的條件，分析UV脅迫對棉鈴蟲成蟲體內(nèi)保幼激素的影響，以期為進(jìn)一步闡明棉鈴蟲對UV照射的生理生化響應(yīng)機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

所用棉鈴蟲為湖北省昆蟲資源利用與害蟲可持續(xù)治理重點實驗室長期喂養(yǎng)的蟲系，幼蟲用人工飼料飼養(yǎng)，飼料配方參考Wu和Gong的配方［19］，飼喂10%的蜂蜜水，室內(nèi)飼養(yǎng)條件為：溫度（27±1）℃、相對濕度70%±10%、光周期L14∥D10。剛羽化出來的雌蛾用于試驗。

1.2 主要儀器和試劑

UV燈（320～390nm，20W）購自江蘇華東電子管廠；UV照度計（TN－2340）購自 TAINA公司；Waters 2695液相色譜儀購自美國沃特世公司；保幼激素JHⅠ和JHⅡ標(biāo)準(zhǔn)樣品購自捷克SciTech公司，保幼激素JHⅢ標(biāo)準(zhǔn)樣品購自美國Sigma公司；試驗所用正己烷、甲醇均為進(jìn)口的色譜純試劑。

1.3 UV照射處理

取棉鈴蟲蛹，待其羽化后，置于交配籠（30cm×30cm×45cm）中，以10%的蜂蜜水作為營養(yǎng)補(bǔ)充液。棉鈴蟲羽化后每天從暗期開始后1h對棉鈴蟲成蟲進(jìn)行UV照射，直到全部試驗結(jié)束。UV照射時間分別為0h／d（對照組），1h／d，5h／d和9h／d。試驗過程中試蟲所處環(huán)境溫度和室內(nèi)飼養(yǎng)條件一致。連續(xù)取1日齡至5日齡的棉鈴蟲雌蛾，試驗處理完畢后立即置于液氮冷凍，然后保存于－80℃冰箱備用。

1.4 保幼激素的提取

保幼激素的抽提參照Gharib和Reggi［20］的方法，并做了優(yōu)化。用超純水洗掉試蟲蟲體表面雜質(zhì)，濾紙吸干水分后稱重。按每0.1mg加入1mL的勻漿液（正己烷∶甲醇＝2∶1），勻漿，然后10 000r／min離心10min，分別吸取正己烷相和甲醇相。沉淀再用600μL的混合液（正己烷與甲醇體積比＝1∶2）重復(fù)抽提一次，合并兩次的各個抽提相。再用500μL的正己烷重洗甲醇相一次，10 000r／min離心10min。合并所有的正己烷相，充分混勻后10 000r／min離心10min，去除雜質(zhì)和不溶物，吸取上清，用于保幼激素的測定。

1.5 保幼激素含量測定

保幼激素的滴定采用高效液相色譜分析法，使用美國Waters2695分析型高效液相色譜檢測儀，Waters C18（5μm，4.6mm×250mm），DAD紫外檢測器。所有樣品上機(jī)前用高純氮氣吹干，用流動相定容至500μL。

保幼激素色譜工作條件：流動相為V（甲醇）∶V（水）＝80∶20；流速0.8mL／min；紫外檢測波長為220nm，進(jìn)樣量50μL，柱溫25℃，以峰面積定量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

保幼激素滴度的試驗數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件 （SPSS Inc.，Chicago，Illinous，U.S.A）中 的General Linear Model進(jìn)行雙因素方差分析，兩個因素分別為UV照射時間和日齡，平均數(shù)采用Tukey法進(jìn)行顯著性檢驗，圖中數(shù)值代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 保幼激素滴定度的時間動態(tài)

試驗分別對JHⅠ、JHⅡ、JHⅢ3種保幼激素標(biāo)樣進(jìn)行HPLC分析，調(diào)整分離條件。最后確定的最佳分離條件為流動相V（甲醇）∶V（水）＝80∶20，流速為0.8mL／min。3種保幼激素標(biāo)樣的保留時間根據(jù)其分子的極性差異有所不同，極性最強(qiáng)的JHⅢ最先出峰，保留時間為10.0min左右，JHⅡ次之，13.3min左右出峰；JHⅠ的極性最低，16.0min左右才出峰（圖1）。在本試驗條件下，JHⅠ、JHⅡ、JHⅢ能夠在棉鈴蟲成蟲中檢測到（圖2），進(jìn)一步證實了鱗翅目昆蟲中存在保幼激素JHⅠ、JHⅡ和JHⅢ。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品JHⅠ、JHⅡ、JHⅢ的HPLC圖

2.2 UV照射對棉鈴蟲JHⅠ滴度的影響

用上述方法測定不同日齡和不同UV處理時間的棉鈴蟲成蟲JHⅠ的滴度變化（圖3）。結(jié)果表明，棉鈴蟲體內(nèi)JHI的滴度隨日齡的變化發(fā)生了顯著改變（F＝24.529，p＜0.01，df＝4，59）；與1日齡相比，CK、1h／d、5h／d組在2、3、4日齡的JHⅠ滴度均升高；其中，在2日齡時，JHⅠ的滴度達(dá)到最大，且達(dá)到顯著水平，然后隨著日齡的增大逐漸下降，9h／d組JHⅠ滴度則隨著日齡的增加而顯著降低。棉鈴蟲體內(nèi)JHⅠ的滴度隨著UV照射時間的延長也出現(xiàn)了顯著變化（F＝86.796，p＜0.01，df＝3，59）；與對照組相比，2、3、4、5日齡的5h／d、9h／d的 UV處理組JHⅠ滴度顯著降低；其中，9h／d的UV處理組JHⅠ滴度最低。此外，日齡與UV照射的交互作用顯著（F＝5.049，p＜0.01，df＝12，59）。

2.3 UV照射對棉鈴蟲JHⅡ滴度的影響

由圖4可知，棉鈴蟲體內(nèi)JHⅡ的滴度隨日齡的變化發(fā)生了顯著改變（F＝23.785，p＜0.01，df＝4，59）；與1日齡相比，CK、1h／d、5h／d組在2、3、4、5日齡的JHⅡ滴度均升高；CK組的JHⅡ滴度在3日齡時達(dá)到最大，且達(dá)到顯著水平，然后隨著日齡的增大逐漸下降；1h／d和5h／d組的JHⅡ滴度在2日齡時達(dá)到最大，且達(dá)到顯著水平，然后隨日齡的增大逐漸下降；9h／d組的JHⅡ滴度則隨著日齡的增大而降低，且在4、5日齡達(dá)到顯著水平。棉鈴蟲體內(nèi)JHⅡ的滴度隨著UV照射時間的延長也出現(xiàn)了顯著的變化（F＝132.758，p＜0.01，df＝3，59）；與對照組相比，2、3、4、5日齡的5h／d與9h／d處理組JHⅡ的滴度顯著降低，其中，9h／d的UV處理組JHⅡ滴度最低。此外，日齡與UV照射的交互作用顯著（F＝5.772，p＜0.01，df＝12，59）。

圖4 UV照射和日齡對棉鈴蟲成蟲JHⅡ滴度的影響

2.4 UV照射對棉鈴蟲JHⅢ滴度的影響

由圖5可知，棉鈴蟲體內(nèi)JHⅢ的滴度隨日齡的變化發(fā)生了顯著改變（F＝29.499，p＜0.01，df＝4，59）；與1日齡相比，CK、1h／d、5h／d組在2、3、4、5日齡的JHⅢ滴度均升高；CK和5h／day組的JHⅢ滴度在2日齡時達(dá)到最大，且達(dá)到顯著水平，然后隨著日齡的增大逐漸下降；1h／d組JHⅢ滴度在3日齡時達(dá)到最大，且達(dá)到顯著水平，然后隨日齡的增大逐漸下降；9h／d組JHⅢ滴度則隨著日齡的增加而降低，且在4、5日齡達(dá)到顯著水平。棉鈴蟲體內(nèi)JHⅢ的滴度隨著UV照射時間的延長也出現(xiàn)了顯著的變化（F＝80.262，p＜0.01，df＝3，59）；與對照組相比，2、3、4、5日齡的5h／d與9h／d處理組JHⅢ滴度均降低，其中，9h／d的UV處理組JHⅢ滴度最低，且達(dá)到顯著水平。此外，日齡與UV照射的交互作用顯著（F＝4.103，p＜0.01，df＝12，59）。

圖5 UV照射和日齡對棉鈴蟲成蟲JHⅢ滴度的影響

3 結(jié)論與討論

保幼激素是一類重要的激素，它幾乎參與了昆蟲所有的生理活動、生長發(fā)育過程以及生殖過程［14－16］。昆蟲體內(nèi)有許多不同類型的保幼激素，但是昆蟲種類不同，JH的結(jié)構(gòu)也有所不同?，F(xiàn)有研究表明，大多數(shù)昆蟲只存在JHⅢ，如中華通草蛉［Chrysoperla sinica（Tjeder）］，蝶蛹金小蜂［Pteromalus puparum（Linnaeus）］等；部分含有JHⅡ和JHⅢ，如松墨天牛（Monochamus alternatus Hope）、煙粉虱［Bemisia tabaci（Gennadius）］等；而鱗翅目昆蟲則含有JH0、JHⅠ、JHⅡ、JHⅢ、B3等多種保幼激素，如谷實夜蛾［Helicoverpa zea（Boddie）］、煙芽夜蛾［Heliothis virescens（F.）］等。在本研究中，JHⅠ、JHⅡ和JHⅢ均能在棉鈴蟲成蟲體內(nèi)檢測到，表明棉鈴蟲含有這3種保幼激素，這與Fan等［21］的研究結(jié)論一致。

近年來的研究表明，UV照射能使昆蟲體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，對昆蟲造成環(huán)境脅迫。Lopez－Martinez等［11］研究表明不同照射時間的UV脅迫能夠引起南極搖蚊（Belgica antarctica Jacobs）體內(nèi)超氧化物歧化酶及過氧化氫酶基因表達(dá)量的變化。Meng等［10，12－13，22］的 研 究 結(jié) 果 也 顯 示 UV 照 射 能 對棉鈴蟲造成氧化脅迫，能夠引起其體內(nèi)抗氧化酶活性、解毒酶活性及幾種同工酶譜帶的變化，并發(fā)現(xiàn)UV照射下棉鈴蟲體內(nèi)參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA加工、蛋白質(zhì)加工、氧化還原平衡等過程的33個蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了變化。本文研究了UV照射對棉鈴蟲雌蛾體內(nèi)3種保幼激素JHⅠ、JHⅡ、JHⅢ含量的影響。結(jié)果表明：隨著UV照射時間的延長，3種保幼激素的滴度均發(fā)生顯著變化，與對照相比，照射時間為5 h／d和9h／d時，2、3、4、5日齡棉鈴蟲體內(nèi)的JHⅠ、JHⅡ和JHⅢ滴度均顯著下降；9h／d的UV處理組JHⅡ滴度最低；日齡與UV照射的交互作用顯著。這說明UV照射能夠影響棉鈴蟲體內(nèi)的保幼激素代謝水平，特別是長時間的UV照射能夠顯著降低棉鈴蟲成蟲體內(nèi)的保幼激素含量。保幼激素在昆蟲體內(nèi)具有重要的生理功能，如促進(jìn)生殖細(xì)胞分化、卵黃發(fā)生、附腺發(fā)育，以及啟動生殖相關(guān)的代謝等［14－16，23－24］，本研 究 中 UV 照 射 顯 著 降 低 了 棉 鈴 蟲體內(nèi)保幼激素的含量，可能意味著UV照射對棉鈴蟲造成了脅迫，從而迫使其改變了體內(nèi)的激素分泌水平。這 也 與 Lopez－Martinez等［11］、Meng等［12－13］的研究結(jié)果相符合，進(jìn)一步證實了UV能對趨光昆蟲造成環(huán)境壓力，能夠影響蟲體內(nèi)的多種生理狀態(tài)。此外，試蟲體內(nèi)保幼激素代謝水平的改變也可能是其對環(huán)境脅迫的一種適應(yīng)反應(yīng)，但其具體的調(diào)控機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究。

［1］ Meyer－Rochow V B.Risks，especially for the eye，emanating from the rise of solar UV－radiation in the Arctic and Antarctic regions［J］.International Journal of Circumpolar Health，2000，59（1）：38－51.

［2］ Schauen M，Hornig－Do H T，Schomberg S，et al.Mitochondrial electron transport chain activity is not involved in ultraviolet A （UVA）－induced cell death［J］.Free Radical Biology ＆Medicine，2007，42（4）：499－509.

［3］ Jurkiewicz B A，Buettner G R.Ultraviolet light－induced free radical formation in skin：an electron paramagnetic resonance study［J］.Photochemistry Photobiology，1994，59（1）：1－4.

［4］ Vile G F，Tyrrell R M.UVA radiation－induced oxidative damage to lipids and proteins in vitro and in human skin fibroblasts is dependent on iron and singlet oxygen［J］.Free Radical Biology and Medicine，1995，18（4）：721－730.

［5］ McMillan T J，Leatherman E，Ridley A，et al.Cellular effects of long wavelength UV light（UVA）in mammalian cells［J］.Journal Pharmacy Pharmacology，2008，60（8）：969－976.

［6］ Mazza C A，Izaguirre M M，Zavala J，et al.Insect perception of ambient ultraviolet－B radiation［J］.Ecology Letters，2002，5（6）：722－726.

［7］ Cowan T，Gries G.Ultraviolet and violet light：attractive orientation cues for the Indian meal moth，Plodia interpunctella［J］.Entomologia Experimentalis et Applicata，2009，131（2）：148－158.

［8］ Gunn A.The determination of larval phase coloration in the African armyworm Spodoptera exempta and its consequences for thermoregulation and protection from UV light［J］.Entomologia Experimentalis et Applicata，1998，86（2）：125－133.

［9］ Zhang C Y，Meng J Y，Wang X P，et al.Effects of UV－A exposures on longevity and reproduction in Helicoverpa armigera，and on the development of its F1generation［J］.Insect Science，2011，18（6）：697－702.

［10］ 孟建玉，張長禹，雷朝亮.紫外線照射對棉鈴蟲成蟲幾種同工酶的影響［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，31（1）：69－72.

［11］ Lopez－Martinez G，Elnitsky M A，Benoit J B，et al.High resistance to oxidative damage in the antarctic midge Belgica antarctica，and developmentally linked expression of genes encoding superoxide dismutase，catalase and heat shock proteins［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2008，38（8）：796－804.

［12］ Meng J Y，Zhang C Y，Zhu F，et al.Ultraviolet light－induced oxidative stress：effects on antioxidant response of Helicoverpa armigera adults［J］.Journal of Insect Physiology，2009，55（6）：588－592.

［13］ Meng J Y，Zhang C Y，Lei C L.A proteomic analysis of Helicoverpa armigera adults after exposure to UV light irradiation［J］.Journal of Insect Physiology，2010，56（4）：405－410.

［14］ 王蔭長.昆蟲生物化學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［15］ Goodman W G，Granger N A.The juvenile hormones［M］∥Gilbert L I，ed.Comprehensive Molecular Insect Science.Elsevier Ltd.，Oxford，2005：319－408.

［16］ Rauschenbach Y，Bogomolova E V，Gruntenko N E，et al.Effects of juvenile hormone and 20－h(huán)ydroxyecdysone on alkaline phosphatase activity in Drosophila under normal and heat stress conditions［J］.Journal of Insect Physiology，2007，53（6）：587－591.

［17］ 丁巖欽，高慰曾，李典謨.夜蛾趨光特性的研究：棉鈴蟲和煙青蟲成蟲對單色光的反應(yīng)［J］.昆蟲學(xué)報，1974，17（3）：307－317.

［18］ 魏國樹，張青文，周明牂，等.棉鈴蟲蛾復(fù)眼光反應(yīng)特性［J］.昆蟲學(xué)報，2002，45（3）：323－328.

［19］ Wu K J，Gong P Y.A new and practical artificial diet for the cotton bollworm［J］.Insect Science，1997，4（3）：277－282.

［20］ Gharib B，Reggi M D.Changes in ecdysteroid and juvenile hormone levels in developing eggs of Bombyx mori［J］.Journal Insect of Physiology，1983，29（12）：871－876.

［21］ Fan Y L，Rafaeli A，Gileadi C，et al.Juvenile hormone induction of pheromone gland PBAN－responsiveness in Helicoverpa armigerafemales［J］.Insect Biochemistry Molecular Biology，1999，29（7）：635－641.

［22］ 孟建玉，張長禹，雷朝亮.紫外線脅迫對棉鈴蟲成蟲乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的影響［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（4）：107－109.

［23］ Riddiford L M.Cellular and molecular actions of juvenile hormones.I：General considerations and premetamorphic actions［J］.Advances in Insect Physiology，1994，24（18）：213－273.

［24］ 王滿囷，李周直.鞭角華扁葉蜂保幼激素滴度的動態(tài)［J］.林業(yè)科學(xué)，2002，38（5）：83－85.