李 飛， 吳青君， 徐寶云， 謝 文， 王少麗， 張友軍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

西花薊馬［Frankliniella occidentalis （Pergande）］是世界性的、園藝作物上最重要的害蟲之一［1］，2003年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)并迅速上升為保護(hù)地蔬菜和花卉上的主要害蟲之一［2］。西花薊馬除可以直接取食造成危害外，還能夠傳播多種植物病毒，西花薊馬是番茄斑點(diǎn)萎蔫病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）最有效的傳播媒介，其傳播病毒病造成的危害損失遠(yuǎn)大于其本身的危害。番茄斑萎病毒屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus），于1915年由Brittlebank首次在澳大

利亞發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在世界上多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛分布，侵染煙草、大豆、番茄、花生、辣椒、萵苣、菊花等作物及多種雜草等900多種植物，是全世界10種危害性最大的植物病毒之一［3］，在我國(guó)被列為進(jìn)境植物檢疫的危險(xiǎn)性有害生物。雖然我國(guó)早在1984年就從花生上分離到 TSWV［4］，在四川曬煙上也發(fā)現(xiàn)TSWV的危害［5］，但其后的10多年來并未廣泛流行，因此未有進(jìn)一步的研究。近年來，在西花薊馬發(fā)生重災(zāi)區(qū)的云南，不斷在花卉和煙草上檢測(cè)到番茄斑萎病毒屬病毒，并呈迅速蔓延之勢(shì)，對(duì)云南的煙草和花卉產(chǎn)業(yè)已構(gòu)成巨大威脅［6－7］。

2012年5 月，筆者在田間調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)西花薊馬為害嚴(yán)重的辣椒上出現(xiàn)枯斑、黃色環(huán)狀紋等疑似番茄斑萎病毒病的癥狀，作者對(duì)海淀區(qū)疑似植物樣品和西花薊馬發(fā)生嚴(yán)重的昌平地區(qū)的植物樣品進(jìn)行了鑒定，并測(cè)定了植物上發(fā)生的西花薊馬是否攜帶番茄斑萎病毒。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

辣椒葉片采于海淀區(qū)的2個(gè)日光溫室和1個(gè)連棟玻璃溫室內(nèi)，葉片表現(xiàn)褪綠環(huán)斑、壞死斑、同心環(huán)癥狀，采回實(shí)驗(yàn)室立即鑒定。茄子樣品采于昌平的日光溫室，葉片表現(xiàn)黃綠不均，成斑駁狀，上面有薊馬幼蟲及為害狀。分別從兩種作物上采集50頭左右薊馬，首先鑒定是否為西花薊馬，然后檢測(cè)是否帶毒。

1.2 主要試劑

Trizol總RNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；TaKaRa RT－PCR試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq 10Master Mix，北京奧賽博科技發(fā)展有限公司；蛋白酶K，天根生化科技（北京）有限公司；樹脂，Sigma公司；TSWV快速檢測(cè)試紙條，安德珍生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 薊馬種類的鑒定

薊馬基因組DNA的提取參照White等的方法并稍加改進(jìn)［8］。將單頭西花薊馬置于滴有3μL蛋白酶K parafilm膜上，以200μL PCR管底部作為勻漿器充分研磨，勻漿液移入200μL PCR管，然后加入20μL的樹脂，混勻之后置于37℃恒溫水浴1 h，每隔15min振蕩1次，然后金屬浴96℃10min，于－20℃保存?zhèn)溆?。西花薊馬的鑒定參照孟祥欽SCAR分子檢測(cè)技術(shù)［9］，上游引物堿基序列為：5′－GAAACTACTATTGTTTGTGAGCTG－3′，下游引物 堿 基 序 列 為：5′－AAGAAACTAAC－GTGAAGGATACTC－3′。

1.4 TSWV快速試紙條檢測(cè)

取一片3cm×4cm帶有疑似癥狀的葉片，將葉片放入提取液瓶中，蓋緊蓋子用力搖動(dòng)20s，直到液體變?yōu)榘稻G色。然后用滴管將液體滴2滴到試紙條的點(diǎn)樣孔中，大約30s后可以看到試紙條的窗口區(qū)變?yōu)樗{(lán)色，等到對(duì)照C線顯現(xiàn)后，即可查看結(jié)果。如果T線顯現(xiàn)，說明該樣品為陽(yáng)性，T線的顏色比較深說明帶毒量比較高，顏色淺說明帶毒量少，如果沒有T線，說明該樣品為陰性。

1.5 RT－PCR檢測(cè)

參考天根的Trizol總RNA提取試劑盒說明書提取葉片及西花薊馬的總RNA，樣品于－80℃保存?zhèn)溆?。然后按照TaKaRa RT－PCR試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成，－20℃保存樣品。采用Vaira等［10］設(shè)計(jì)的引物：NF302：5′－GGGTCAGGCTTGTTGAGGAAAC－3′ 和 NR575：5′－TTCCCTAAGGCTTCCCTGGTG－3′。PCR 反應(yīng)體系為 20μL：cDNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、2×Taq10Master Mix 10μL、ddH2O 7μL，PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性2min；40個(gè)循環(huán)：94℃30s、60℃30s、72℃30s；最后72℃延伸5min［11］。擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1.5%凝膠電泳檢測(cè)，預(yù)測(cè)條帶為273bp。

將PCR產(chǎn)物交由北京六合華大基因科技股份有限公司（BGI）測(cè)序，將獲得的序列通過BLAST進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 薊馬種類的鑒定

以薊馬的DNA為模板，以2條SCAR引物：FOMF／FOMR分別進(jìn)行擴(kuò)增。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，能擴(kuò)增出一條西花薊馬特有的條帶，得到320bp左右的目的片段（圖1），表明上述植物上發(fā)生的薊馬種類為西花薊馬。

圖1 薊馬種類鑒定結(jié)果電泳圖

2.2 TSWV試紙條檢測(cè)結(jié)果

用滴管將葉片提取液滴2滴到試紙條的點(diǎn)樣孔中，約30s后可以看到試紙條的窗口區(qū)變?yōu)樗{(lán)色，大約2min后對(duì)照C線顯現(xiàn)，具有褪綠環(huán)斑的葉片均顯示T線（圖2a），表明該葉片均帶有番茄斑萎病毒。而癥狀輕的葉片，T線不明顯（圖2b），需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 RT－PCR檢測(cè)結(jié)果

采用引物NF302／NR575對(duì)番茄斑萎病毒屬病毒N基因序列進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，表現(xiàn)褪綠環(huán)紋癥狀的辣椒葉片樣品、癥狀不明顯的辣椒和茄子樣品以及同時(shí)采集的西花薊馬均可獲得273bp左右的目的條帶（圖3、圖4），與預(yù)期結(jié)果一致，表明采集的辣椒、茄子樣品可能被番茄斑萎病毒侵染，西花薊馬可能攜帶番茄斑萎病毒。

圖2 TSWV試紙條檢測(cè)

2.4 獲得目的片段的序列比對(duì)

將測(cè)得的目的基因片段進(jìn)行序列測(cè)定，通過BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增的273bp與番茄斑萎病毒屬病毒的N基因序列有98%的相似性，進(jìn)一步證明上述植物樣品的確受番茄斑萎病毒屬病毒侵染，而且薊馬體內(nèi)也攜帶番茄斑萎病毒屬病毒。

3 討論

通過采用番茄斑萎病毒的快速試紙條檢測(cè)，以及進(jìn)一步的RT－PCR和序列測(cè)定證實(shí)，在北京局部地區(qū)的辣椒和茄子上已發(fā)生番茄斑萎病毒病，這兩種作物上同時(shí)發(fā)生的薊馬種類主要為西花薊馬，并且攜帶該病毒。由薊馬傳播的番茄斑萎病毒位列世界10大重要病毒病的第2位［3］，曾對(duì)西班牙東南部的溫室番茄、辣椒和花卉造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到50%［12］，在美國(guó)夏威夷、巴西、意大利和南非，番茄斑萎病毒病在20世紀(jì)80－90年代的某些年份流行導(dǎo)致番茄、萵苣等作物近乎絕產(chǎn)［13］。眾所周知，西花薊馬目前已遍布我國(guó)北京、云南、山東、貴州、新疆等地［14］，對(duì)各地的蔬菜和花卉作物造成嚴(yán)重危害。世界各國(guó)的事實(shí)表明，伴隨西花薊馬在世界范圍內(nèi)的廣泛傳播與擴(kuò)散，常導(dǎo)致番茄斑萎病毒病的發(fā)生與流行。如果由西花薊馬傳播的番茄斑萎病毒病大面積發(fā)生，加上種苗調(diào)運(yùn)的遠(yuǎn)距離傳播，將對(duì)我國(guó)農(nóng)作物特別是經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的蔬菜和花卉作物生產(chǎn)造成毀滅性的災(zāi)害。為此，建議有關(guān)部門立即采取相應(yīng)的預(yù)防與管理措施，首先查明番茄斑萎病毒病在我國(guó)的分布現(xiàn)狀，同時(shí)開展相應(yīng)的控制技術(shù)研究，防止其擴(kuò)散蔓延。

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