李嘉杰，聞海兵，鄒樹峰，嚴 劍，洪 濤

（1.南昌大學醫(yī)學院研究生院 330000；2.南昌大學第一附屬醫(yī)院神經外科 330006）

縫隙連接蛋白（connexin，Cx）可能與體內腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程有著密切的聯(lián)系，Cx43作為Cx家族最常見的一種，其表達量的改變直接影響縫隙連接的功能，導致體內腫瘤的發(fā)生。前期體外研究發(fā)現(xiàn)，轉染Cx43cDNA的C6細胞縫隙連接功能增強，化療的旁觀者效應明顯放大。然而，Cx43在體內是否也有同樣的作用還不得而知，為此本研究通過構建Cx43真核表達質粒，并將其轉染到人神經膠質瘤U251細胞中穩(wěn)定過表達，從體內觀察Cx43對腦膠質瘤侵襲性的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器 人神經膠質瘤U251細胞由杭州生物技術公司提供。主要試劑：pcDNA3.1載體、LipofectamineTM－2000、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，感受態(tài)細胞DH5α、TaqDNA聚合酶、限制性內切酶、T4連接酶，凝膠回收試劑盒、B型小提質粒試劑盒及G418購自上海天根生化科技有限公司，逆轉錄試劑盒為美國Promega公司產品，兔抗Cx43Total購自美國Zymed公司，兔抗β－actin為美國Chemicon公司產品，羊抗兔第二抗體購自美國Santa Cruz公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和青鏈霉素混合液為美國HyClone公司產品。主要儀器：倒置相差顯微鏡（日本Olympus）、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國Bio－rad）、紫外分光光度計（美國 Bio－rad）、凝膠成像儀（美國Bio－rad）。

1.2 pcDNA3.1／Cx43真核表達質粒的構建

1.2.1 U251細胞總RNA的提取 按RNeasy Mini Kit（德國QIAGEN）說明書提取總RNA。

1.2.2 逆轉錄 PCR（reverse transcriptase－PCR，RT－PCR）擴增人Cx43基因蛋白編碼序列子 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫人Cx43基因序列（CR541660），利用Vector NTI Advance 10軟件自行設計Cx43基因的全長引物（上游：5′－GTG CTA GCT TAT GGG TGA CTG GAG CGC C－3′；下 游：5′－GCG GGT ACC CAG GAT CTC CAG GTC AT－3′，分別帶有 NheⅠ和KpnⅠ酶切位點，擴增產物長1 168bp）。β－actin引物采用上海閃晶分子生物技術研究所的β－actin序列（上游：5′－CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC－3′，下游：5′－TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC－3′，擴增產物長150bp）。兩對引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以提取的總RNA為模板，用ReverTra Ace－αTMKit（天根生化科技有限公司）反轉錄合成cDNA第一條鏈。取反轉錄產物2μL，PCR擴增Cx43編碼序列，PCR反應條件為：94℃預變性3min，94℃變性60s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共33個循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR擴增產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像儀分析并進行照相。用DNA凝膠回收試劑盒（安徽U－GENE公司）切膠回收Cx43PCR產物。

1.2.3 pCMV－Cx43cDNA重組質粒的構建 NheⅠ和KpnⅠ限制性內切酶對Cx43RT－PCR擴增產物及pcDNA3.1質粒進行雙酶切，酶切產物切膠回收后用高效DNA連接酶，16℃連接16h；將連接產物轉化至E.coli DH5α感受態(tài)細菌，G418平板篩選。挑取陽性克隆，搖菌過夜，提取質粒。將構建的重組質粒命名為pcDNA3.1／Cx43。

1.2.4 pCMV－Cx43cDNA重組質粒鑒定 NheⅠ和KpnⅠ限制性內切酶對重組質粒進行單酶切及雙酶切，并送天根生化科技有限公司（北京）進行測序鑒定。

1.3 pcDNA3.1／Cx43重組質粒轉染U251細胞及G418篩選穩(wěn)定轉染細胞系

1.3.1 U251細胞的培養(yǎng) U251細胞在含10%FBS，37℃、95%濕度、5%CO2的 Dulbecco′s改良 Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′medium，DMEM）中常規(guī)培養(yǎng)，每周傳代3次。

1.3.2 U251細胞的轉染與篩選 將處于對數(shù)生長期的U251細胞用0.25%胰蛋白酶－乙二胺四乙酸（美國Gibco公司）消化后吹打成單細胞懸液，轉染24h前將4×105個細胞接種至6孔板中，使轉染時細胞密度達到90%～95%。將LipofectamineTM－2000 10μL加入240μL無血清DMEM中混勻，室溫放置5min；取pcDNA3.1／Cx431重組質粒4μg加入無血清DMEM中混勻（總量250μL），將上述2種液體混勻制成質粒－脂質體混合物，室溫放置20min。用無血清DMEM洗滌細胞3次，將質粒－脂質體混合物逐滴滴加至6孔板中，輕輕混勻，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5h后更換為完全培養(yǎng)基（含10%FBS）；24h后按1∶6傳代；24h后，待細胞貼壁，換為含800μg／mL G418的完全培養(yǎng)基篩選3周，得到抗性克隆，用無菌移液器槍頭挑取單克隆繼續(xù)培養(yǎng)2周以上，以獲得穩(wěn)定細胞系。

1.4 RT－PCR檢測穩(wěn)定轉染U251細胞及未轉染U251細胞中Cx43的基因表達水平 用TRIzol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄后行PCR檢測，PCR反應條件為：94℃預變性3min，94℃變性60s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共33個循環(huán)，最后72℃延伸5min。同時，內參β－actin以等量的RNA為模板，同時進行PCR擴增，PCR反應條件為：94℃預變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共28個循環(huán)，最后72℃延伸5min。

1.5 Weston blot檢測穩(wěn)定轉染U251細胞及未轉染U251細胞中Cx43蛋白的表達水平 用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，取20μL體積上樣，積層膠電泳15min，電壓120V；分離膠電泳45min，電壓180V；轉膜90min，電流350mA；5%的含吐溫－20的 Tris緩沖液（Tris－buffered saline with Tween－20，TBST）脫脂奶粉室溫下封閉2h；加入兔抗Cx43抗體4℃孵育過夜；然后用TBST液洗滌3次，每次10min，加入第二抗體室溫下孵育4h，再用TBST液洗滌3次，每次10min，曝光。

2 結 果

2.1 PCR擴增獲取Cx43序列 PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后得到大小約1 168bp的特異性單一條帶，經比對與基因庫公布的基因大小相同，見圖1。

2.2 質粒pcDNA3.1（＋）單酶切鑒定 鑒定結果顯示出現(xiàn)大小約5 400bp條帶，與預期相符，見圖2。

圖1 PCR擴增的Cx43

圖2 質粒pcDNA3.1（＋）的單酶切鑒定

2.3 pcDNA3.1／Cx43重組質粒的雙酶切鑒定 用NheⅠ、KpnⅠ雙酶切pcDNA3.1／Cx43重組質粒，經PCR鑒定，單酶切重組質粒大小約6 000bp，而雙酶切后出現(xiàn)1條大小約5 000bp及1條大小約1 000bp條帶，且雙酶切后出現(xiàn)的大小約1 000bp條帶與重組質粒目的基因Cx43的PCR結果在同一水平線上，其大小與基因庫所提供的基本符合，酶切重組質粒酶切結果與預期結果相同，見圖3。

2.4 pcDNA3.1／Cx43重組質粒測序報告 結果顯示與基因庫序列一致。序列如下（斜體為Cx43cDNA全序列）：AGC AGA GCT CTC TGG CTA CTA GAG AAC CCA CTG CTT ACT GGC TTA TCG AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCC AAG CTG GCT AGC ATG GGT GAC TGG AGC GCC TTA GGC AAA CTC CTT GAC AAG GTT CAA GCC TAC TCA ACT GCT GGA GGG AAG GTG TGG CTG TCA GTA CTT TTC ATT TTC CGA ATC CTG CTG CTG GGG ACA GCG GTT GAG TCA GCC TGG GGA GAT GAG CAG TCT GCC TTT CGT TGT AAC ACT CAG CAA CCT GGT TGT GAA AAT GTC TGC TAT GAC AAG TCT TTC CCA ATC TCT CAT GTG CGC TTC TGG GTC CTG CAG ATC ATA TTT GTG TCT GTA CCC ACA CTC TTG TAC CTG GCT CAT GTG TTC TAT GTG ATG CGA AGG GAA GAG AAA CTG AAC AAG AAA GAG GAA GAA CTC AAG GTT GCC CAA ACT GAT GGT GTC AAT GTG GAC ATG CAC TTG AAG CAG ATT GAG ATA AAG AAG TTC AAG TAC GGT ATT GAA GAG CAT GGT AAG GTG AAA ATG CGA GGG GGG TTG CTG CGA ACC TAC ATC ATC AGT ATC CTC TTC AAG TCT ATC TTT GAG GTG GCC TTC TTG CTG ATC CAG TGG TAC ATC TAT GGA TTC AGC TTG AGT GCT GTT TAC ACT TGC AAA AGA GAT CCC TGC CCA CAT CAG GTG GAC TGT TTC CTC TCT CGC CCC ACG GAG AAA ACC ATC TTC ATC ATC TTC ATG CTG GTG GTG TCC TTG GTG TCC CTG GCC TTG AAT ATC ATT GAA CTC TTC TAT GTT TTC TTC AAG GGC GTT AAG GAT CGG GTT AAG GGA AAG AGC GAC CCT TAC CAT GCG ACC AGT GGT GCG CTG AGC CCT GTC AAA GAC TGT GGG TCT CAA AAA TAT GCT TAT TTC AAT GGC TGC TCC TCA CCA ACC GCT CCC CTC TCG CCT ATG TCT CCT CCT GGG TAC AAG CTG GTT ACT GGC GAC AGA AAC AAT TCT TCT TGC CGC AAT TAC AAC AAG CAA GCA AGT GAG CAA AAC TGG GCT AAT TAC AGT GCA GAA CAA AAT CGA ATG GGG CAG GCG GGA AGC ACC ATC TCT AAC TCC CAT GCA CAG CCT TTT GAT TTC CCC GAT GAT AAC CAG AAT TCT AAA AAA CTA GCT GCT GGA CAT GAA TTA CAG CCA CTA GCC ATT GTG GAC CAG CGA CCT TCA AGC AGA GCC AGC AGT CGT GCC AGC AGC AGA CCT CGG CCT GAT GAC CTG GAG ATC CTG GGT ACC GAG CTC GGA TCC ACT AGT CCA GTG TGG TGG AAT TCT GCA GAT ATC CAG CAC AGT GGC GGC CGC TCG AGT CTA GAG CCC C。

圖3 pcDNA3.1／Cx43重組質粒的雙酶切鑒定

2.5 穩(wěn)定轉染及未轉染U251細胞中Cx43的表達水平 RTPCR結果顯示未轉染及轉染空質粒的U251細胞中Cx43表達較低且無明顯差異，而穩(wěn)定轉染重組質粒的U251細胞則高表達Cx43，見圖4。

2.6 穩(wěn)定轉染U251細胞中Cx43蛋白的表達水平 Weston blot結果顯示在過表達的U251細胞內Cx43蛋白表達水平明顯高于未轉染陰性對照組，見圖5。

圖4 穩(wěn)定轉染及未轉染U251細胞中Cx43基因的表達水平

圖5 穩(wěn)定轉染U251細胞中Cx43蛋白的表達水平

3 討 論

縫隙連接蛋白是構成縫隙連接通道的基本單位，目前在哺乳動物體內發(fā)現(xiàn)的縫隙連接蛋白已有20余種［1］，其相對分子質量為20 000～56 000，根據(jù)其相對分子質量的不同分為Cx26、Cx43及Cx56等。在不同的組織中縫隙連接蛋白的表達并不相同，如在腎組織中以Cx26的表達為主，而在腦組織中則以Cx43的表達最為廣泛［2－3］。Cx43是含有1 146bp的cDNA開放讀碼框所編碼的含有382個氨基酸殘基的單肽［4］，Cx43由核糖體合成后被轉運至高爾基體，最后聚集在細胞膜上形成縫隙連接［5］，在此過程中Cx43修飾狀態(tài)及表達量的改變都會影響到縫隙連接的功能，最后導致疾病的發(fā)生。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Cx43在維持神經系統(tǒng)正常功能中發(fā)揮重要作用，其表達的改變可能與多種神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關；有研究提示Cx43可能參與蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的發(fā)生［6－7］；張永明等［8］研究發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后 Cx43的表達上升，提示其可能參與了顱腦損傷的病理形成過程，并且可能與繼發(fā)性腦損傷的加重有關；Garbelli等［9］研究表明在難治性癲癇患者的腦組織中Cx43的表達升高，提示Cx43表達的改變可能與難治性癲癇的發(fā)病有關。有研究提示Cx43也參與了其他腦血管疾病的發(fā)生與發(fā)展過程，如帕金森病、腦動脈粥樣硬化等［10－11］。

神經膠質瘤來自神經系統(tǒng)支持組織，屬神經外胚葉腫瘤，占顱內腫瘤的35.26%～60.96%，是顱內腫瘤中最常見的一種［12－13］，其發(fā)病機制復雜。人們對其發(fā)病機制存在不同看法：Ding等［14］發(fā)現(xiàn)水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）在調控神經膠質瘤細胞的遷移和侵襲性方面發(fā)揮著重要作用，認為AQP4可能與神經膠質瘤的發(fā)展有著密切的聯(lián)系；Xie等［15］發(fā)現(xiàn)，在不同病理類型和分級的神經膠質瘤中結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）mRNA的表達不同，在神經膠質瘤Ⅰ～Ⅱ級中的表達明顯低于在神經膠質瘤Ⅲ～Ⅳ級中的表達，因此認為CTGF可能在神經膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用。而近年Caltabiano等［16］的研究卻發(fā)現(xiàn)級別越高的星型神經膠質瘤中Cx43的表達越高，可見Cx43在神經膠質瘤的發(fā)展過程中具有重要的作用。作者希望通過構建重組過表達Cx43質粒，將其轉染到神經膠質瘤細胞，改變其Cx43的表達，為下一步進行神經膠質瘤體內的侵襲性研究奠定實驗基礎。

［1］ Liao Y，Day KH，Damon DN，et al.Endothelial cell－specific knockout of connexin 43causes hypotension and bradycardia in mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（17）：9989－9994.

［2］ S?hl G，Willecke K.Gap junctions and the connexin protein family［J］.Cardiovasc Res，2004，62（2）：228－232.

［3］van Veen AA，van Rijen HV，Opthof T.Cardiac gap junction channels：modulation of expression and channel properties［J］.Cardiovasc Res，2001，51（2）：217－229.

［4］ Yancey SB，John SA，Lal R，et al.The 43－kD polypeptide of heart gap junctions：immunolocalization，topology，and functional domains［J］.J Cell Biol，1989，108（6）：2241－2254.

［5］ Saez JC，Berthoud VM，Branes MC，et al.Plasma membrane channels formed by connexins：their regulation and functions［J］.Physiol Rev，2003，83（4）：1359－1400.

［6］ Wang H，Hong T，Wang H，et al.Altered expression of connexin43and its possible role in endothelin－1－induced contraction in rabbit basilar artery［J］.Neurol Res，2009，31（1）：67－73.

［7］ Hong T，Wang H，Wang Y，et al.Effects of gap junctional blockers on cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in rabbits［J］.Neurol Res，2009，31（3）：238－244.

［8］ 張永明，漆松濤，黃廣龍，等.縫隙連接蛋白Cx43在爆炸傷兔腦組織中的表達［J］.中國微侵襲神經外科雜志，2010，6（15）：279－281.

［9］ Garbelli R，F(xiàn)rassoni C，Condorelli DF，et al.Expression of connexin 43in the human epileptic and drug－resistant cerebral cortex［J］.Neurology，2011，76（10）：895－902.

［10］Johnstone SR，Ross J，Rizzo MJ，et al.Oxidized phospholipid species promote in vivo differential cx43phosphorylation and vascular smooth muscle cell proliferation［J］.Am J Pathol，2009，175（2）：916－924.

［11］Kawasaki A，Hayashi T，Nakachi K，et al.Modulation of connexin 43in rotenone－induced model of Parkinson′s disease［J］.Neuroscience，2009，160（1）：61－68.

［12］張紀.深入開展膠質瘤綜合治療及其基礎研究［J］.中華神經外科雜志，2003，19（1）：1－2.

［13］朱麗麗.王忠誠院士解讀腦膠質瘤［J］.抗癌之窗，2010（1）：17－18.

［14］Ding T，Ma Y，Li W，et al.Role of aquaporin－4in the regulation of migration and invasion of human glioma cells［J］.Int J Oncol，2011，38（6）：1521－1531.

［15］Xie D，Yin D，Wang HJ，et al.Levels of expression of CYR61and CTGF are prognostic for tumor progression and survival of individuals with gliomas［J］.Clin Cancer Res，2004，10（6）：2072－2081.

［16］Caltabiano R，Torrisi A，Condorelli D，et al.High levels of connexin 43mRNA in high grade astrocytomas.Study of 32cases with in situ hybridization［J］.Acta Histochem，2010，112（6）：529－535.