高強 苑霞青 王瑋 漆紅蘭

(陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 陜西西安 710062)

為適應(yīng)大學(xué)化學(xué)實驗課程中綜合創(chuàng)新型實驗教學(xué)改革的需要，教師應(yīng)不斷設(shè)計出理論合理、表征方法(技術(shù))先進、并能激發(fā)學(xué)生創(chuàng)造潛能的綜合創(chuàng)新型實驗[1-2]。因此，在現(xiàn)有化學(xué)實驗教學(xué)體系基礎(chǔ)上，探索通過實驗教學(xué)提高學(xué)生創(chuàng)新能力的途徑和方法，使學(xué)生接觸更多學(xué)科前沿、更多技術(shù)手段的科研實踐是必要的。

我們結(jié)合科研工作,開發(fā)了綜合創(chuàng)新型教學(xué)實驗——熒光小分子2-氨基-7-甲基-1,8-萘啶(AMND)與存在堿基缺失損傷的dsDNA相互作用的研究[3]。設(shè)計的各部分實驗內(nèi)容既相互聯(lián)系，又各自獨立，使學(xué)生能從各分支學(xué)科的結(jié)合上學(xué)習(xí)解決綜合性問題的方法，進一步提高科學(xué)思維能力和創(chuàng)新意識。

本實驗要求學(xué)生學(xué)會計算給定序列單鏈DNA的摩爾吸光系數(shù)，并掌握配制準(zhǔn)確濃度的單鏈DNA(ssDNA)溶液的方法，使用紫外-可見分光光度法研究小分子和dsDNA的相互作用，用熒光滴定法測量小分子與dsDNA的結(jié)合常數(shù)，學(xué)習(xí)用圓二色光譜表征小分子與dsDNA相互作用并對光譜變化提出合理的解釋，考察影響小分子與dsDNA相互作用的因素。

1 實驗?zāi)康?/h2>

學(xué)習(xí)利用光譜學(xué)方法研究DNA與小分子相互作用的原理；掌握紫外-可見光譜儀，熒光光譜儀及圓二色光譜儀的原理和使用；熟悉小分子與DNA相互作用、分子識別、弱相互作用等概念。

2 實驗原理

DNA存儲著生物體的遺傳信息，因此維護DNA分子的完整性對細胞至關(guān)重要。外界環(huán)境和生物體內(nèi)部的因素都可能導(dǎo)致DNA分子的損傷或改變，此類損傷往往會對細胞乃至生物體造成嚴(yán)重影響。單個堿基缺失位點(AP位點)是DNA損傷的主要類型，因此AP位點的含量水平是評價細胞DNA損傷的一個非常有效的指標(biāo)。本實驗設(shè)計了一個熒光檢測AP位點的方法，實驗原理如圖1所示。AP位點的出現(xiàn)導(dǎo)致雙鏈中AP位點處的堿基成為未配對堿基且在未配對堿基對面形成疏水空腔，這一空腔為DNA靶向小分子通過氫鍵選擇性結(jié)合到AP位點的未配對堿基提供了必要的疏水環(huán)境。2-氨基-7-甲基-1,8-萘啶(AMND)是一種具有抗菌和抗癌活性的DNA靶向雜環(huán)小分子，具有良好的熒光性質(zhì)且能和胞嘧啶形成很好的氫鍵結(jié)合[4]。在AMND溶液中加入AP位點損傷的dsDNA，AMND就會進入dsDNA中的AP位點，通過氫鍵結(jié)合對面的胞嘧啶堿基。這一結(jié)合過程伴隨著AMND熒光的明顯猝滅。通過檢測小分子熒光強度的變化，不僅可以檢測dsDNA中AP位點的存在，還可以確定AP位點處的堿基類型。本實驗現(xiàn)象明顯，重復(fù)性好，所有試劑和藥品都是商品化試劑且價格便宜，整個實驗過程沒有特別復(fù)雜的操作，因而比較適合作為本科生綜合創(chuàng)新實驗。

圖1 實驗原理及AMND與胞嘧啶形成的氫鍵結(jié)構(gòu)

3 試劑與儀器

3.1 試劑

3.2 儀器

UV-2450PC紫外-可見分光光度計(日本島津)，Cary Eclipse熒光儀(美國瓦里安)，圓二色光譜儀(Chirascan Instrument，Applied Photophysics Ltd，UK)，PCR儀。

4 實驗內(nèi)容

4.1 DNA儲備液的配置

將裝有ssDNA的離心管在4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，按照說明書加入適量的超純水溶解，振蕩離心后得到ssDNA儲備溶液。吸取10μL該溶液至離心管中，稀釋10～20倍后，測量其在260nm處的吸光度。根據(jù)文獻計算ssDNA的摩爾吸光系數(shù)[5]，依據(jù)朗伯-比爾定律計算稀釋后的ssDNA溶液濃度，推算儲備ssDNA溶液濃度。將ssDNA儲備液保存在5℃冰箱中，實驗前用緩沖溶液稀釋。

4.2 AMND溶液的配制

配制2.0×10-3mol·L-1AMND儲備溶液的方法如下：用分析天平準(zhǔn)確稱取AMND，用超純水溶解定容至100mL。將儲備液裝入棕色試劑瓶保存在5℃冰箱中，實驗前用緩沖溶液稀釋。

4.3 dsDNA 的制備

為得到配對工整且存在AP位點的dsDNA，需將兩個ssDNA溶液等量混合后放入PCR儀中進行溫育?？販爻绦驗椋簩⑷芤荷郎刂?5℃，停留10min，然后以-0.5℃/min的速度緩慢降溫至5℃并停留10min，之后使其自然恢復(fù)到室溫。

4.4 AMND的紫外和熒光光譜

配制合適濃度的AMND溶液，以空白緩沖溶液為參比溶液在200～400nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，找到AMND的最大吸收波長。然后以AMND的最大吸收波長為激發(fā)波長，掃描AMND的熒光光譜。

4.5 紫外-可見分光光度法考察dsDNA與AMND的相互作用

圖2 AMND與dsDNA相互作用的紫外-可見光譜圖dsDNA的濃度：1—0mol·L-1;2—5.0×10-6mol·L-1;3—1.0×10-5mol·L-1;4—2.5×10-5mol·L-1;5—5.0×10-5mol·L-1;6—1.0×10-4mol·L-1

4.6 熒光法測量AMND和dsDNA的結(jié)合常數(shù)

圖3 AMND熒光強度隨dsDNA濃度的變化曲線dsDNA的濃度：1—0mol·L-1;2—5.0×10-6mol·L-1;3—1.0×10-5mol·L-1;4—2.0×10-5mol·L-1;5—2.5×10-5mol·L-1;6—6.0×10-5mol·L-1

4.7 圓二色光譜(CD)測量

配制兩份溶液，分別為dsDNA(4.0×10-5mol·L-1)溶液和AMND(1.0×10-4mol·L-1)-dsDNA(4.0×10-5mol·L-1)的混合溶液。依次將兩個溶液放入圓二色光譜儀，在200～400nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果如圖4所示，單獨的dsDNA在280nm處出現(xiàn)正峰，250nm處出現(xiàn)負峰，符合dsDNA的B型雙螺旋的特征。當(dāng)加入AMND后，dsDNA的光譜發(fā)生了很大變化，280nm處的正峰降低，250nm處的負峰有所增強。這表明dsDNA在與AMND結(jié)合后其構(gòu)象發(fā)生了變化。

圖4 與AMND作用前后dsDNA 的圓二色光譜圖

4.8 考察影響AMND與dsDNA相互作用的因素

改變?nèi)芤簆H(pH 分別為6.5，7.0，7.4，8.0)及離子強度(NaCl濃度分別為0.1mol·L-1，0.2mol·L-1，0.5mol·L-1，1.0mol·L-1)等條件，重復(fù)上述實驗，觀察各因素對AMND與dsDNA相互作用的影響并解釋可能的原因。

5 思考題

(1) 小分子為何能在水溶液中通過氫鍵相互作用結(jié)合到胞嘧啶(C)。

(2) AMND結(jié)合到胞嘧啶堿基時為什么會產(chǎn)生熒光猝滅。

(3) 如果AP位點處的堿基是其他堿基,AMND是否也可以與dsDNA結(jié)合并產(chǎn)生熒光猝滅。

本實驗綜合運用了多種操作方法，使用了多種儀器，可以提高學(xué)生對各種現(xiàn)代化儀器的認知能力和操作能力; 同時本實驗又涉及到前沿研究的熱點——DNA與小分子的相互作用，有利于激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情和培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識。

[1] 張建民,陳衛(wèi)華,石秋芝.大學(xué)化學(xué),2011,26(1):66

[2] 張雷,楊良準(zhǔn).大學(xué)化學(xué),2010,25(4):55

[3] 胡亮亮,薄紅艷,高強,等.中國科學(xué):化學(xué),2011,41(11):1732

[4] Sato Y,Nishizawa S,Yoshimoto K,etal.NucleicAcidsRes,2009,37:1411

[5] Puglisi J D,Tinoco I Jr.MethodEnzymol,1989,180:304

[6] Connors K A.Binding Constants.New York:John Wiley & Sons,1987