秦 雯，曲 睿，汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞電生理研究室，安徽 蕪湖 241002)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是指?jìng)€(gè)體由于遭受到對(duì)生命具有威脅的事件或嚴(yán)重創(chuàng)傷，導(dǎo)致癥狀長(zhǎng)期持續(xù)的精神障礙。其主要的特征性癥狀包括對(duì)創(chuàng)傷的反復(fù)性體驗(yàn)、持久性回避和警覺(jué)性增高［1－2］。與創(chuàng)傷記憶相關(guān)聯(lián)的癥狀即條件性恐懼，據(jù)此可以建立PTSD動(dòng)物模型，即通過(guò)給予動(dòng)物嚴(yán)重的創(chuàng)傷應(yīng)激，測(cè)試動(dòng)物行為和生理的變化，以變化呈現(xiàn)應(yīng)激強(qiáng)度(劑量)依賴(lài)性，并可持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間或隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)為特征［3－5］。目前研究最多的是與創(chuàng)傷記憶相聯(lián)系的聯(lián)想性學(xué)習(xí)的恐懼性條件反射(fear conditioning)，表現(xiàn)為病理性重現(xiàn)、回避和對(duì)創(chuàng)傷線索的高度警覺(jué)反應(yīng)等癥狀，即為條件性恐懼記憶的PTSD模型［4－8］。為此，本文通過(guò)恐懼性刺激形成條件性恐懼記憶的方法制備大鼠PTSD干預(yù)的影響，特別已有研究顯示不同的給藥途徑如灌胃或腹腔注射(ip)均會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自主活動(dòng)產(chǎn)生影響［9］，特通過(guò)腹腔注射這一干預(yù)措施，觀察其對(duì)模型大鼠條件性恐懼記憶的影響，為進(jìn)一步研究PTSD的恐懼記憶機(jī)制和干預(yù)治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 動(dòng)物雄性SD大鼠38只，由南京青龍山動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量(137．1±21．5)g。實(shí)驗(yàn)前，大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，晝夜周期為12 h/12 h(8∶00開(kāi)燈，20∶00熄燈)，室溫控制在(22±3)℃，每籠4只，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)期間，實(shí)驗(yàn)者每天撫摸大鼠5 min左右，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)者操作。

1．2 儀器設(shè)備美國(guó)San Diego公司的Freeze Monitor System(恐懼監(jiān)測(cè)系統(tǒng))，包括3個(gè)測(cè)試箱，可提供光、聲及足底電刺激，以及恐懼反應(yīng)(木僵反應(yīng))檢測(cè)，均通過(guò)Freeze Monitor軟件由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制完成。Morris水迷宮系統(tǒng)由自制的圓形不銹鋼水池、Smart視頻追蹤系統(tǒng)的紅外攝像頭，以及大鼠行為Morris實(shí)驗(yàn)軟件(中科院心理健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室隋南實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))組成，其游泳軌跡記錄和參數(shù)分析均由計(jì)算機(jī)自動(dòng)完成。

1．3 PTSD模型制備與木僵時(shí)間檢測(cè) 參考文獻(xiàn)［4］并根據(jù)預(yù)試情況作刺激參數(shù)的適當(dāng)調(diào)整，制備PTSD模型。第1、2天:大鼠置于測(cè)試箱中，適應(yīng)2 min，每天檢測(cè)基礎(chǔ)木僵時(shí)間(即檢測(cè)大鼠同時(shí)阻斷三條紅外射線以前木僵狀態(tài)持續(xù)的時(shí)間)［10］。第3～5天上午:大鼠分別置于3個(gè)測(cè)試箱，適應(yīng)2 min后開(kāi)始“聲音-電擊”配對(duì)刺激。20 min/d，先給予15 s聲音信號(hào)刺激，最后的10 s施加足底電擊(3 mA)，重復(fù)20次，間隔隨機(jī)。以此建立聲音與電刺激的配對(duì)條件性恐懼反應(yīng)(PTSD造模)。造模完成24 h后進(jìn)行條件性恐懼監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)指標(biāo)為木僵時(shí)間，以木僵時(shí)間百分比表示(即累計(jì)木僵時(shí)間占總監(jiān)測(cè)時(shí)間的百分比)。檢測(cè)日共檢測(cè)30次，每次持續(xù)監(jiān)測(cè)10 s，總監(jiān)測(cè)時(shí)間5 min。以木僵時(shí)間百分比達(dá)50%以上，為鑒定大鼠PTSD模型的標(biāo)準(zhǔn)。

1．4 動(dòng)物分組和腹腔注射干預(yù) 將造模后大鼠按其木僵時(shí)間百分比分層隨機(jī)抽取14只，均分為2組:對(duì)照組和生理鹽水組。生理鹽水組于建模后行生理鹽水腹腔注射(ip，4 ml/kg，qd)，連續(xù)2周，觀察其對(duì)條件性恐懼反應(yīng)的影響。對(duì)照組不做任何處理。兩組模型大鼠均在生理鹽水組干預(yù)后第2、4、8、15天進(jìn)行木僵時(shí)間檢測(cè)，監(jiān)測(cè)時(shí)間5 min，10 s/次，以觀察條件性恐懼記憶的消退情況。

1．5 Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試［11－12］

1．5．1 尋找平臺(tái)訓(xùn)練方法 大鼠在進(jìn)行正式測(cè)試前，先進(jìn)行游泳以及尋找可視平臺(tái)的訓(xùn)練。訓(xùn)練時(shí)，將不銹鋼可視平臺(tái)置于迷宮水池的中心，臺(tái)面高出水面1 cm，每只大鼠先置于平臺(tái)上適應(yīng)20 s，隨后訓(xùn)練3次，隨機(jī)從不同象限的入水點(diǎn)投入水中，學(xué)習(xí)尋找平臺(tái)60 s，若超過(guò)60 s仍未找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)至平臺(tái)上停留15 s，然后取出。

1．5．2 定位航行實(shí)驗(yàn) 為期7 d，將透明平臺(tái)置于4個(gè)象限中任一象限1/2弧度，池壁到池中心距離1/2的位置，水面高于臺(tái)面1 cm。每天測(cè)試1次，含分別從4個(gè)象限(順序隨機(jī))面向池壁入水的4個(gè)測(cè)試，每個(gè)測(cè)試間隔30 s。大鼠在水中游泳的時(shí)間記為逃避潛伏期;若大鼠60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)其登上平臺(tái)并停留15 s，此時(shí)的逃避潛伏期計(jì)為60 s。

1． 5空間探索實(shí)驗(yàn)第7天定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束1 h后，將平臺(tái)撤離，大鼠從原平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限入水，測(cè)試空間探索實(shí)驗(yàn)1次。分析記錄大鼠在60 s內(nèi)穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果以ˉx±s表示。用配對(duì)t檢驗(yàn)比較處理前后的差異，用單因素方差分析(oneway ANOVA)分析模型大鼠條件性恐懼記憶的消退情況，用重復(fù)測(cè)量的雙因素方差分析(two-way ANOVA)比較腹腔注射干預(yù)和對(duì)照組間條件性恐懼記憶的消退情況。

2 結(jié)果

2．1 聲音-電擊配對(duì)刺激對(duì)大鼠木僵時(shí)間百分比的影響38只大鼠經(jīng)過(guò)連續(xù)3 d的聲音-電擊配對(duì)刺激后，木僵時(shí)間百分比由刺激前的(18．63±9．76)%增加到(59．01 ±20．44)%(配對(duì) t檢驗(yàn)，P＜0．01，圖1A)，其中有28只大鼠的木僵時(shí)間百分比≥50%，達(dá)到條件性恐懼記憶的PTSD模型的鑒定標(biāo)準(zhǔn)(成功率為73．7%)。

2．2 木僵時(shí)間百分比與體質(zhì)量的相關(guān)性分析經(jīng)直線相關(guān)分析顯示，38只大鼠聲音-電擊配對(duì)刺激作用的效果(木僵時(shí)間百分比)與體質(zhì)量成一定的正相關(guān)關(guān)系(r=0．4200，P ＜0．01，圖 1B)。

圖1 聲音-電擊配對(duì)刺激對(duì)大鼠木僵時(shí)間百分比的影響

2．3 腹腔注射干預(yù)對(duì)模型大鼠體質(zhì)量的影響分析木僵反應(yīng)檢測(cè)日2組模型大鼠體質(zhì)量數(shù)據(jù)，重復(fù)測(cè)量雙因素 ANOVA顯示，測(cè)試間 F(4，48)=589．0，P ＜0．01;處理間 F(1，12)＜1，P ＞0．05。提示兩組大鼠的體質(zhì)量均呈現(xiàn)增長(zhǎng)，但兩組間差異沒(méi)有顯著性意義。

圖2 腹腔注射(ip)干預(yù)對(duì)模型大鼠體質(zhì)量的影響

2．4 腹腔注射干預(yù)對(duì)模型大鼠木僵反應(yīng)的影響對(duì)模型制作后大鼠進(jìn)行5次測(cè)試的木僵時(shí)間百分比數(shù)據(jù)(圖3)，兩組分別進(jìn)行單因素ANOVA分析，結(jié)果對(duì)照組的測(cè)試次間 F(4，30)=2．25，P ＞0．05，提示模型動(dòng)物恐懼記憶的消退無(wú)顯著性意義，PTSD模型有一定穩(wěn)定性;而生理鹽水組的測(cè)試次間F(4，30)=14．67，P ＜0．01，表明該組模型動(dòng)物恐懼記憶有明顯的消退。對(duì)干預(yù)后的4次測(cè)試木僵時(shí)間百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量雙因素ANOVA分析顯示，測(cè)試次間 F(3，36)=7．09，P ＜ 0．01，處理組間 F(1，12)=4．83，P ＜0．05，提示 ip 生理鹽水干預(yù)具有促進(jìn)模型動(dòng)物恐懼記憶消退的作用。

圖3 腹腔注射干預(yù)對(duì)模型大鼠木僵時(shí)間百分比的影響

2．5 腹腔注射干預(yù)對(duì)模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響2組大鼠Morris水迷宮測(cè)試的數(shù)據(jù)中，第1～7天各組定位航行實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4A，其重復(fù)測(cè)量雙因素ANOVA顯示，測(cè)試日間F(6，72)=11．46，P ＜0．01，處理組間 F(1，12)＜1，P＞0．05，提示2組大鼠的Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)能力差異無(wú)顯著性意義?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，2組大鼠的穿臺(tái)次數(shù)(圖4B)，兩組 t檢驗(yàn):P＞0．05，結(jié)果提示2組大鼠Morris水迷宮空間記憶能力差異無(wú)顯著性意義。

圖4 腹腔注射干預(yù)對(duì)模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

3 討論

制備重復(fù)性和穩(wěn)定程度均較好的PTSD動(dòng)物模型，是開(kāi)展PTSD相關(guān)動(dòng)物研究的基礎(chǔ)，也是本文旨在探討的首要問(wèn)題。關(guān)于動(dòng)物PTSD模型，盡管種類(lèi)很多，仍沒(méi)有能代表PTSD全部核心癥狀、理想的動(dòng)物模型［13］。與創(chuàng)傷記憶相聯(lián)結(jié)的條件性恐懼是PTSD最典型的癥狀之一，也是PTSD治療的重點(diǎn)與難點(diǎn)，故通過(guò)電刺激形成條件性恐懼記憶是最常用的 PTSD 模型之一［3，6，13］。制備 PTSD 動(dòng)物模型，特別是形成條件性恐懼記憶的模型，首先要考慮刺激的強(qiáng)度，應(yīng)以能引起動(dòng)物明確的恐懼反應(yīng)又不對(duì)動(dòng)物造成軀體傷害為目標(biāo)。本文參考文獻(xiàn)報(bào)道的刺激強(qiáng)度［4］，并在預(yù)試過(guò)程中，反復(fù)根據(jù)不同年齡的大鼠進(jìn)行電擊強(qiáng)度的觀察和相應(yīng)調(diào)整，確定3 mA為有效的非條件刺激，能夠較好地建立聲音的條件刺激與足底電擊的非條件刺激的聯(lián)接。其次要考慮條件性恐懼的檢測(cè)指標(biāo)，應(yīng)盡量避免檢測(cè)操作的干擾和人為的主觀影響。本文一方面采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制、紅外監(jiān)測(cè)、與環(huán)境隔音的恐懼監(jiān)控系統(tǒng)檢測(cè)大鼠的木僵反應(yīng)，并采用木僵時(shí)間百分比作為觀察指標(biāo)。與造模前的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，盡管不同動(dòng)物的效果不一，甚至有的動(dòng)物在造模處理后木僵時(shí)間百分比可以降低，但總體比較造模處理后木僵時(shí)間百分比明顯升高，通過(guò)造模前后木僵時(shí)間百分比數(shù)據(jù)的分布情況，設(shè)定了木僵時(shí)間百分比≥50%為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，其成功率為73．7%。最后更要考慮模型的穩(wěn)定性，形成的條件性恐懼記憶至少要有較慢的消退速度，才能進(jìn)行后續(xù)干預(yù)或治療的試驗(yàn)。本文通過(guò)從造模處理后24 h到第15 d的觀察(對(duì)照組)，5次木僵時(shí)間百分比檢測(cè)結(jié)果顯示差異沒(méi)有顯著性意義，表明條件性恐懼記憶具有比較穩(wěn)定的特性，為以后進(jìn)行干預(yù)或治療的研究提供了可靠的模型基礎(chǔ)。

條件性恐懼記憶的PTSD模型是以經(jīng)典的巴甫洛夫條件反射為基礎(chǔ)的［6］，條件性恐懼記憶是情緒性記憶的一種，情緒性記憶由杏仁核為中心的多個(gè)腦區(qū)共同作用產(chǎn)生［14］。經(jīng)典巴甫洛夫條件反射性恐懼的中樞神經(jīng)環(huán)路是以杏仁核為中心，島葉、海馬、邊緣皮層以及小腦共同參與形成的［6，15］。條件性恐懼記憶的消退機(jī)制與內(nèi)側(cè)前額葉皮層(mPFC)，尤其是腹內(nèi)側(cè)前額葉皮層(vmPFC)的功能激活密切相關(guān)［16］。已有研究顯示vmPFC活動(dòng)增強(qiáng)有助于條件性恐懼記憶的消退，參與消退記憶的鞏固、保持與表達(dá)［5，8］。

PTSD的臨床治療目前主要有心理治療和藥物治療兩個(gè)方面。心理治療主要是認(rèn)知暴露療法、心理疏導(dǎo)、行為治療等［17］。藥物治療主要是用抗抑郁藥(首選藥是5-羥色胺再攝取抑制劑)減少多巴胺釋放，使用抗驚厥藥提升氨基丁酸(GABA)的功能，用抗焦慮藥(如苯二氮艸卓類(lèi)藥物)改善GABA的功能從而調(diào)節(jié)多巴胺等遞質(zhì)釋放［17－18］。由此可見(jiàn)，無(wú)論是在PTSD的機(jī)制研究，還是在PTSD的干預(yù)和治療研究中，用藥是經(jīng)常需要采用的方法之一。鑒于用藥等操作過(guò)程不僅對(duì)患者有安慰劑效應(yīng)，即使在動(dòng)物試驗(yàn)中也是一種刺激甚至是應(yīng)激因子，對(duì)PTSD模型的影響也是進(jìn)一步研究需要注意的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射這一模擬藥物治療中常采用的動(dòng)物試驗(yàn)操作措施，來(lái)觀察其對(duì)條件性恐懼記憶的影響。結(jié)果顯示腹腔注射生理鹽水干預(yù)即具有影響恐懼記憶消退的作用。盡管不能因此而認(rèn)為生理鹽水具有促進(jìn)恐懼記憶消退的作用，但腹腔注射作為一種刺激或應(yīng)激，對(duì)模型大鼠恐懼記憶有促進(jìn)消退作用的可能性，不僅要求在類(lèi)似的動(dòng)物模型研究中必須考慮類(lèi)似或相關(guān)因素的影響，嚴(yán)格對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，同時(shí)也提示類(lèi)似的干預(yù)措施有可能會(huì)與相關(guān)治療或干預(yù)方法產(chǎn)生相互影響。至于腹腔注射干預(yù)的作用機(jī)制，可能是由于阻斷了恐懼記憶的再鞏固。已有研究表明，恐懼記憶在提取時(shí)會(huì)出現(xiàn)消退和再鞏固兩種機(jī)制。消除恐懼記憶的方法可歸結(jié)為增強(qiáng)恐懼記憶的消退以及抑制恐懼記憶的再鞏固［7，19］，這樣在記憶被重新提取的再鞏固的同時(shí)，施以行為或藥物的干預(yù)措施，可能有助于消退恐懼記憶。

(致謝:王邦安高級(jí)實(shí)驗(yàn)師提供部分技術(shù)協(xié)助。)

［1］ 王玉龍，謝偉，楊智輝，等．PTSD在中國(guó)的研究進(jìn)展［J］．應(yīng)用心理學(xué)，2005，11(2):176 －180．

［2］ 張婭玲，白艷秋，彭正午，等．創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)的生物學(xué)研究概述［J］．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，11(1):172 －175．

［3］ COHEN H，KOZLOVSKY N，ALONA C，et al．Animal model for PTSD:From clinical concept to translational research［J］．Neuropharmacology，2012，62(2):715 －724．

［4］ 王禾，廖維宏，吳寶明，等．創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠動(dòng)物模型行為學(xué)表現(xiàn)及學(xué)習(xí)記憶功能的變化［J］．中國(guó)臨床康復(fù)，2004，3(10):1848－1850．

［5］ 安獻(xiàn)麗，王文忠，鄭希耕．阻礙條件性恐懼記憶消退的原因分析［J］．心理科學(xué)進(jìn)展，2009，17(1):126 －131．

［6］ JOHNSON LR，MCGUIRE J，LAZARUS R，et al．Pavlovian fear memory circuits and phenotype models of PTSD［J］．Neuropharmacology，2012，62(2):638 －646．

［7］ 王紅波，安獻(xiàn)麗，李幼紅，等．干預(yù)條件性恐懼記憶表達(dá)的相關(guān)影響因素分析［J］．心理科學(xué)進(jìn)展，2010，18(5):718 －724．

［8］ QUIRK GJ，GARCIA R，LIMA FG．Prefrontal mechanisms in extinction of conditioned fear［J］．Biol Psychiatry，2006，60(4):337－343．

［9］ 劉天雅，洪宗元．灌胃與腹腔注射對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響［J］．皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，29(4):421 －423．

［10］ JIN XC，MA CL，LI BM．The α2A-adrenoceptor agonist guanfacine improves spatial learning but not fear conditioning in rats［J］．Acta Physiol Sin，2007，59(6):739 －744．

［11］ VORHEESCV，WILLIAMSMT．Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］．Nature Protocols，2006，1(2):848 －858．

［12］秦雯，曲睿，汪萌芽．大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試的時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系［J］．皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，29(6):462 －465．

［13］劉媛，王莉，伍亞民．創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型［J］．中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)，2010，18(4):436 －439．

［14］唐向陽(yáng)，汪凱，程懷東．情緒記憶的神經(jīng)機(jī)制［J］．臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2008，21(5):399 －400．

［15］ KIM JJ，JUNG MW．Neural circuits and mechanisms involved in pavlovian fear conditioning:a critical review［J］．Neurosci Biobehav Rev，2006，30(2):188 －202．

［16］ PETERSJ，KALIVAS PW，QUIRK GJ．Extinction circuits for fear and addiction overlap prefrontal cortex［J］．Learn Mem，2009，16(5):279－288．

［17］張?zhí)?，傅安球．?chuàng)傷后應(yīng)激障礙的生物學(xué)影響因素及相關(guān)藥物治療的研究進(jìn)展［J］．東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，30(4):649－652．

［18］ DAVIS M，MYERS KM，CHHATWAL J，et al．Pharmacological treatments that facilitate extinction of fear:relevance to psychotherapy［J］．NeuroRx，2006，3(1):82 －96．

［19］ SCHILLER D，MONFILSMH，RAIO CM，et al．Preventing the return of fear in humans using reconsolidation update mechanisms［J］．Nature，2010，463(7277):49 －53．