雷 萍，吳亞召，張飛龍，張文雋，董艷鶴，王成章，宮 坤

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.西安市生漆研究所，陜西 西安 710061）

漆酶（Laccases） 是一種結(jié)合多個銅離子的蛋白質(zhì)，屬于銅藍氧化酶，該酶最早是在漆樹的汁液中發(fā)現(xiàn)的，故將其命名為漆酶；此后在多種植物、高等真菌[1]、少數(shù)細菌及昆蟲體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)[2]。漆酶可存活于空氣中，發(fā)生反應后唯一的產(chǎn)物就是水，因此本質(zhì)上是一種環(huán)保型酵素。由于這幾年環(huán)保意識逐漸被人所重視，因此近年來漆酶也成為眾多學者的研究對象。

漆酶獨特的催化特性使其在生物檢測中有廣泛的應用，作為高效的生物檢測器而成為底物、輔酶、抑制劑等成分分析的有效工具和手段，在生物制漿、生物漂白、以及有毒化合物的降解等方面具有潛在應用價值，因而引起人們越來越多的研究興趣，成為環(huán)境保護用酶研究的熱點[3]。近年來，人們對漆酶的研究越來越深入，其應用的范圍也越來越廣泛。

漆酶屬于藍-銅族氧化酶，其活性中心由4個銅原子組成，在氧化還原反應中起著決定作用。漆酶的Ⅰ型銅原子和氨基酸殘基結(jié)合成為單核中心，是酶表現(xiàn)為明顯的藍色。另外，它還包含Ⅱ型和Ⅲ型銅原子，構(gòu)成三核中心。Ⅰ型銅原子作為初級電子的接受者，參與分子內(nèi)的電子傳遞，把電子從底物傳遞到其他銅原子上，然后電子結(jié)合于三核位點。該位點進一步把電子傳遞給結(jié)合活性中心的第二底物氧分子，使之還原為水，而銅的存在是形成復合體所必需的[4]。它們催化的反應是利用分子氧，產(chǎn)生的副產(chǎn)物只有水，所以又稱漆酶為“生態(tài)友善酶”。

盡管漆酶在自然界中廣泛分布，但真正具有較高漆酶產(chǎn)量的菌株并不多，分泌漆酶的真菌主要分布于擔子菌（Basidiom ycotina）、多孔菌、子囊菌、脈胞菌（Neurospora）、柄孢殼菌和曲霉菌等屬種，其中最主要的是擔子菌亞門的白腐菌真菌，研究也較多[5，6]。但是大部分真菌發(fā)酵周期較長，使得工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的局限性。

本研究室前期通過野外采集分離篩選獲得1株桑黃菌[7]，目前還未見關于桑黃菌產(chǎn)漆酶的相關報道。本試驗對其液體發(fā)酵進行了研究，初步篩選出適宜菌絲體生長的液體培養(yǎng)基配方，為進一步開發(fā)桑黃菌產(chǎn)品提供了技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

桑黃菌種來自于陜西省微生物研究所微生物資源中心第三研究室。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 母種培養(yǎng)基

采用PDA綜合培養(yǎng)基。

1.2.2 碳源測定

基礎培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、Cu2+60 μmol·L-1[8]、VB110 mg·100-1·mL-1，pH 自然。

1.2.3氮源測定

基礎培養(yǎng)基葡萄糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、Cu2+60 μmol·L-1，VB11 mg·100-1·mL-1，pH 自然。

1.2.4 試驗培養(yǎng)基

將碳源基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖分別以蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉取代，進行碳源試驗；將氮源測定基礎培養(yǎng)基中的蛋白胨分別以酵母膏、麥麩、（NH4）2SO4、黃豆粉、尿素代替進行氮源試驗。

1.2.5 優(yōu)化培養(yǎng)基

試驗以玉米粉（A）、葡萄糖（B）為復合碳源，以麥麩（C）、蛋白胨和酵母膏（D）為復合氮源，采取四因素三水平正交試驗的方法對桑黃菌產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)、發(fā)酵

將一級桑黃菌菌種0.5 cm2接種于裝有100 mL培養(yǎng)液的300 mL三角瓶，28℃條件下，旋轉(zhuǎn)頻率150 r·min-1，28℃搖床培養(yǎng)8 d。

1.3.2 碳源篩選試驗

將桑黃菌在6種不同碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每次試驗重復5次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 氮源篩選試驗

將桑黃菌在6種不同氮源培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每次試驗重復5次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 正交試驗篩選最佳培養(yǎng)基配方

取一級桑黃菌菌種0.5 cm2分別接種于9種不同的正交試驗培養(yǎng)基中，在溫度29℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1條件下培養(yǎng)8 d，每次試驗重復5次，結(jié)果取平均值。試驗因素及其各水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗的因素及水平

1.3.5 粗酶液的制備、漆酶產(chǎn)量測定

發(fā)酵液10 mL經(jīng)4 000 r·min-1、4℃離心15 min，棄去菌絲體，取得的上清液即為粗酶液。將1.0 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚和50 mmol·L-1的琥珀酸（pH4.5） 配成緩沖液，取4 mL緩沖液和1 mL粗酶液，混勻，30℃恒溫水浴反應30 min，在465 nm處測定吸光度，以滅活粗酶液和緩沖液作為對照，計算酶產(chǎn)量。酶活性單位（IU）定義：每分鐘氧化1 μmol愈創(chuàng)木酚所需要的酶量[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對產(chǎn)酶量的影響試驗

在碳源基礎培養(yǎng)基中分別加入各種碳源2%，進行碳源的篩選試驗，試驗重復5次，取每次產(chǎn)酶量平均值。結(jié)果見表2。

表2 不同碳源對桑黃發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響

從表2可以看出，桑黃發(fā)酵產(chǎn)漆酶以玉米粉作為碳源效果最好，其次是葡萄糖、蔗糖等。

2.2 不同氮源對產(chǎn)酶量的影響試驗

在氮源基礎培養(yǎng)基中分別加入各種氮源0.5%，進行氮源的篩選試驗，試驗重復5次，取每次產(chǎn)酶量平均值。結(jié)果見表3。

從表3可以看出，桑黃最適發(fā)酵用氮源為麥麩，其次是黃豆粉、蛋白胨、（NH4）2SO4等。

2.3 正交試驗優(yōu)化桑黃發(fā)酵產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基結(jié)果與直觀分析

正交實驗直觀分析表見表4。

從表4可以看出9個處理中，處理2的產(chǎn)酶量最大7 666 U·L-1。由此得出較優(yōu)的桑黃發(fā)酵生產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基配方為玉米粉1%、麥麩1%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏 0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、Cu2+60 μmol·L-1，VB11 mg·100-1·mL-1。處理6次之，處理3、處理4較差。

表3 不同氮源對桑黃發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響

表4 L9(34)正交試驗結(jié)果直觀分析表

3 討論

通過試驗發(fā)現(xiàn)桑黃菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶最適碳源是玉米粉，氮源為麥麩。葡萄糖也可作為發(fā)酵碳源，但玉米粉價格低廉，本試驗選擇玉米粉做發(fā)酵碳源。

采用正交方法優(yōu)化出了桑黃菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，玉米粉1%、麥麩1%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、Cu2+60 μmol·L-1、VB11 mg·100-1·mL-1。

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