柴紅梅，汪祿祥，和麗忠，趙 靜，黎其萬，趙永昌**

(1.云南省農(nóng)科院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650221；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650221)

我國是食用菌資源最豐富的國家之一，已知接近2 000種，而且近年我國的食用菌栽培產(chǎn)量也高居世界之首。除味道鮮美、是人們喜愛的佐食佳品外，食用菌還含有豐富的營養(yǎng)成份和保健成份，被聯(lián)合國推薦為21世紀(jì)的健康食品。但近年的研究顯示食用菌對(duì)多種重金屬具有高的富集特性，這提示要更加關(guān)注食用菌的栽培和食用安全性。

黑木耳 (Auricularia auricula-judae)是廣受歡迎、食用較多的一種食用菌，野生種在全國大部分地區(qū)有分布，在東北三省和廣東、福建等多省還有大面積袋料栽培。鉻是食用菌中最常見的污染重金屬元素之一，我國的衛(wèi)生指標(biāo)要求黑木耳中鉻濃度要小于1.0 mg·kg-1[1]。本研究中，選擇了黑木耳的2株野生菌株和2株栽培菌株，通過在液體培養(yǎng)基和袋料栽培基質(zhì)中人為添加重金屬鉻，分析不同菌株菌絲體和子實(shí)體對(duì)鉻的富集特性，以期為黑木耳低鉻富集菌株的篩選打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黑木耳菌株

菌株YAASM1399和YAASM1402為野生菌株，分別采集于云南省劍川縣和永平縣。菌株YAASM2691和YAASM2692為栽培菌株，由吉林農(nóng)大提供，原編號(hào)為B12和 B13。

1.1.2 試劑

氯化鎘 (CdCl2·2.5H2O)為國產(chǎn)分析純?cè)噭?，試?yàn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液按GB/T602-2002《化學(xué)試劑-雜質(zhì)測定用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備》中的方法配制。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方

液體培養(yǎng)基配方：蛋白胨0.2%、酵母粉0.2%、葡萄糖2%。

袋料栽培配方：雜木屑78%、粗麥麩20%、白糖1%、石膏1%，水份含量60%~65%。

1.2.2 黑木耳菌絲體對(duì)鉻的富集試驗(yàn)

設(shè)定 4 個(gè)鉻處理濃度為 1 mg·L-1、2 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1，以不添加鉻的搖瓶為對(duì)照，每個(gè)菌株每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。接種5片已活化菌塊 (D=5 mm)于裝有100 mL培養(yǎng)液的250 mL三角錐形瓶中，180 r·min-1、25℃暗培養(yǎng)20 d。發(fā)酵液經(jīng)80目紗布過濾后，所得菌絲體用無菌蒸餾水沖洗3次，60℃烘干至恒重，記錄菌絲體干重，測量菌絲體中的鉻濃度。

1.2.3 黑木耳子實(shí)體對(duì)鉻的富集試驗(yàn)

采用常規(guī)袋栽技術(shù)，選用長30 cm、寬15 cm、厚0.025 cm的高密度聚乙烯袋，每袋裝料1 kg（濕重）。將試驗(yàn)用的鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻于拌料用水中，再與栽培料充分拌勻。設(shè)7個(gè)鉻處理濃度，以不添加鉻的菌袋為對(duì)照，每個(gè)菌株每個(gè)處理設(shè)15個(gè)重復(fù)（15袋）。培養(yǎng)料滅菌后，每個(gè)處理濃度取樣3份，檢測其中鉻的實(shí)際濃度（干重）。按常規(guī)方法接種和出菇管理，第1潮菇全部采收，60℃烘干至恒重，檢測子實(shí)體中的鉻濃度。

1.2.4 重金屬鉻含量的測定

樣品用硝酸-高氯酸消解，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定鉻濃度。

2 結(jié)果

2.1 4株黑木耳菌株菌絲體生物量及鉻濃度

4株黑木耳菌株菌絲體生物量及鉻的含量見表1。隨

表1 4株黑木耳菌株菌絲體生物量及Cd的含量

著鉻濃度增加，兩栽培菌株的生物量呈快速下降趨勢，當(dāng)鉻濃度為5 mg·L-1時(shí)，菌絲體干重已低于兩野生菌株在鉻濃度10 mg·L-1時(shí)的菌絲體干重，而當(dāng)鉻濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí)，兩栽培菌株已幾乎不生長。在鉻濃度低于2 mg·L-1時(shí)，野生菌株YAASM1399的生物量比對(duì)照有小幅增加，說明低鉻濃度對(duì)它的生長有促進(jìn)作用，這與某些文獻(xiàn)報(bào)道相同[2，3]。

液體培養(yǎng)基中鉻的本底濃度為0.003 mg·L-1，因此即使添加的鉻濃度為0，菌絲體中仍檢測到了低濃度的鉻。隨著培養(yǎng)液中鉻濃度的增加，菌絲體中的鉻濃度在極顯著增加，但相互間沒有呈線性相關(guān)。在鉻濃度10 mg·L-1的培養(yǎng)液中，野生菌株YAASM1399和YAASM1402菌絲體中的鉻濃度分別達(dá)到631.84 mg·kg-1和680.16 m·kg-1的較高值，而栽培菌株YAASM2691和YAASM2692不生長，因此沒能得到相關(guān)值。

2.2 4株黑木耳菌株子實(shí)體中的鉻濃度

4株黑木耳菌株子實(shí)體中的鉻含量見表2。

隨著栽培料中鉻濃度的升高，4株黑木耳菌株子實(shí)體中的鉻濃度也在增加，但增加的趨勢較為平緩。

0.18 mg·kg-1為培養(yǎng)料中鉻濃度的背景值，此時(shí)4株黑木耳菌株子實(shí)體中的鉻濃度都未超過1.0 mg·kg-1。除菌株YAASM1402在培養(yǎng)料中鉻濃度小于1 mg·kg-1時(shí)的子實(shí)體鉻富集倍數(shù)在3.0~5.1之間外，其余菌株在不同鉻濃度的子實(shí)體富集倍數(shù)都在較低的0.5~2.6之間變動(dòng)。2株野生菌株YAASM1399和YAASM1402隨著培養(yǎng)料中鉻濃度增加，子實(shí)體中鉻富集倍數(shù)呈下降趨勢。當(dāng)培養(yǎng)料中鉻濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)添加的最高值18.46 mg·kg-1時(shí)，只有菌株YAASM2692子實(shí)體中的鉻濃度超過了這個(gè)值達(dá)到28.88 mg·kg-1，其它3株菌株子實(shí)體中的鉻濃度都低于培養(yǎng)料中的濃度，富集倍數(shù)都低于1。

2.3 同一菌株菌絲體及子實(shí)體中鉻濃度的比較

因袋料栽培時(shí)菌絲體與培養(yǎng)料難以分開，所以較難單獨(dú)測定此時(shí)菌絲體中的鉻濃度，因此用搖瓶培養(yǎng)菌絲體中的鉻濃度作為參考數(shù)值來比較。

從圖1、圖2、圖3、圖4看出，隨著培養(yǎng)基中鉻濃度的增加，4株黑木耳菌株子實(shí)體中的鉻濃度呈緩慢增加，而菌絲體中的鉻濃度急劇增加，在培養(yǎng)基中鉻濃度相同條件下，菌絲體中鉻濃度是子實(shí)體中的10倍~20倍。

大型真菌對(duì)重金屬的耐受及富集能力與環(huán)境因素和大型真菌自身因素都有關(guān)[4,5]，Baldrian發(fā)現(xiàn)側(cè)耳（Pleurotus ostreatus） 在實(shí)驗(yàn)室條件下即使1 mmol·L-1鉻濃度時(shí)都不能生長，但在稻草或土壤中能夠耐受5 mmol·L-1的鉻濃度[6]。本研究中，在搖瓶液態(tài)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中鉻濃度為10 mg·L-1時(shí)，2株栽培菌株已不能生長，兩株野生菌株雖然生長，但生物量很低，而菌絲中的鉻濃度達(dá)到631.84 mg·kg-1，680.16 mg·kg-1的較高值。在袋料栽培固態(tài)培養(yǎng)時(shí)，即使培養(yǎng)料中鉻濃度達(dá)到18.46 mg·kg-1，4株黑木耳菌株都能生長、出菇，只有菌株YAASM2692子實(shí)體中的鉻富集倍數(shù)超過1達(dá)到1.6，其它3株菌株子實(shí)體中的鉻濃度都低于培養(yǎng)料中的濃度，富集倍數(shù)都低于1。由此可見，黑木耳菌株對(duì)鉻的耐受及富集能力與栽培環(huán)境和菌株都有很大關(guān)系。

3 討論

食用菌富集重金屬的特性取決于兩方面因素，一是生長環(huán)境，如土壤、栽培基質(zhì)、空氣、水等；二是食用菌自身的因素，如菌絲體和子實(shí)體的組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征、生長發(fā)育特性等[7]。研究表明，一種食用菌對(duì)不同重金屬的富集是不同的，如巴西蘑菇子實(shí)體富集鉻能力較強(qiáng)，達(dá)13 mg·kg-1～23 mg·kg-1，而 Pb、As、Hg 含量基本正常[8]。不同種類、同種內(nèi)不同菌株間、子實(shí)體不同部位之間對(duì)同一重金屬的富集程度和含量也有差異[9]。徐麗紅等分析3個(gè)香菇品種對(duì)鉻的富集能力，其富集系數(shù)分別為12.47、12.09、8.57[10]。Garcia等在研究中發(fā)現(xiàn)，雞腿菇菌褶中Pb含量平均達(dá)2.06 mg·kg-1，而其余部分Pb含量可以達(dá)到平均2.79 mg·kg-1[11]。

表2 4株黑木耳菌株子實(shí)體中的鉻含量

圖1 菌株YAASM1399菌絲體和子實(shí)體中的鉻濃度比較

圖2 菌株YAASM1402菌絲體和子實(shí)體中的鉻濃度比較

圖3 菌株YAASM2691菌絲體和子實(shí)體中的鉻濃度比較

圖4 菌株YAASM2692菌絲體和子實(shí)體中的鉻濃度比較

本研究中，培養(yǎng)基質(zhì)中鉻濃度相同的情況下，黑木耳菌株液態(tài)搖瓶培養(yǎng)的菌絲體中鉻濃度是固態(tài)袋料栽培子實(shí)體中鉻濃度的10倍～20倍。菌絲體和子實(shí)體中重金屬元素含量與基質(zhì)的組成和性質(zhì)有很大關(guān)系[12]。液體培養(yǎng)基與袋料栽培培養(yǎng)基除組成成份不同外，pH、氧化-還原電位、有機(jī)物含量及其它競爭性金屬離子的含量也不同。液態(tài)培養(yǎng)時(shí)，新生的菌絲體完全浸沒在含鉻的液體環(huán)境中，大量鉻離子吸附在菌絲細(xì)胞表面，當(dāng)細(xì)胞壁上的結(jié)合點(diǎn)達(dá)到飽和時(shí)，重金屬離子將進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。而袋料栽培出菇時(shí)，菇體菌絲已離開培養(yǎng)基，新生菇體菌絲的營養(yǎng)需通過菌絲細(xì)胞間的運(yùn)輸來供給，而前期菌絲細(xì)胞會(huì)通過一些機(jī)制來降低鉻離子對(duì)自身的傷害，因此運(yùn)送到菇體菌絲的鉻離子濃度會(huì)大大降低，這些因素或許可以推測為何菌絲體與子實(shí)體中鉻濃度會(huì)相差如此之大。這也提示我們即使是在鉻污染嚴(yán)重的野生或人工栽培環(huán)境下，黑木耳菌株仍然能生長、出菇，因此栽培時(shí)嚴(yán)格控制培養(yǎng)基質(zhì)和生長環(huán)境不被鉻污染是很重要的。

我國的衛(wèi)生指標(biāo)要求黑木耳中鉻濃度小于1.0mg·kg-1，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，當(dāng)培養(yǎng)料本底鉻濃度為0.18 mg·kg-1時(shí)，4株黑木耳菌株子實(shí)體中的鉻都低于1.0 mg·kg-1，均符合標(biāo)準(zhǔn)，但當(dāng)培養(yǎng)料中鉻濃度達(dá)到0.61 mg·kg-1時(shí)，只有菌株YAASM2692的子實(shí)體中鉻濃度為0.74 mg·kg-1，其它菌株子實(shí)體中的鉻濃度均已超標(biāo)。因不同菌株對(duì)鉻的富集能力不同，因此很難得出黑木耳培養(yǎng)基鉻污染臨界指標(biāo)，選擇對(duì)重金屬富集程度低的優(yōu)異菌株是食品安全的關(guān)鍵之一。本研究中的4株菌株都還不符合要求，選育工作需繼續(xù)進(jìn)行下去。

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