郭一萌，郭春梅，劉淑清，魚紅閃，孫明忠

(1.大連醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧大連 116044;2.大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，遼寧大連 116044;3.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034)

黃酮抑制血小板聚集及其構(gòu)效的研究

郭一萌1，郭春梅2，劉淑清1，魚紅閃3，孫明忠2

(1.大連醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧大連 116044;2.大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，遼寧大連 116044;3.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034)

［目的］比較8種黃酮對血小板聚集的抑制作用并探討其構(gòu)效關(guān)系。［方法］采用體外實(shí)驗(yàn)方法，測定黃酮類化合物對ADP誘導(dǎo)大鼠血小板聚集的抑制作用，并計(jì)算其抑制率。［結(jié)果］槲皮素、蘆丁、異槲皮素、橙皮素、柚皮素、橙皮苷、柚皮苷和淫羊藿苷對血小板聚集的抑制率分別為(68.33±2.43)%、(55.34±2.09)%、(52.27±4.65)%、(50.80 ±7.03)%、(33.07 ±2.09)%、(31.28 ± 4.65)%、(22.91 ±1.68)% 和(20.94 ± 3.20)%，8 種黃酮類化合物對血小板聚集均呈現(xiàn)抑制作用。與對照組(不加黃酮類化合物)相比，差異均有顯著性意義(P＜0.05)。［結(jié)論］黃酮類化合物對血小板聚集有明顯抑制作用，A環(huán)C7位和C環(huán)C3位的羥基是該類化合物抑制血小板聚集發(fā)揮作用的重要功能基團(tuán)。

黃酮類化合物;血小板聚集;結(jié)構(gòu);功能

心腦血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)生與血小板活化和血栓形成密切相關(guān)［1-2］。血小板是骨髓巨核細(xì)胞脫落的細(xì)胞碎片，呈圓盤形，沒有細(xì)胞核，在體內(nèi)通過黏附、聚集來參與止血過程。當(dāng)血小板處于過于活化的病理生理狀態(tài)時(shí)，就會發(fā)生黏附、聚集而促進(jìn)血栓形成;若血栓存在于心臟或大腦血管中，造成心腦血管堵塞，就引發(fā)心梗、腦梗和中風(fēng)［3-5］?？寡“寰奂窃擃惣膊》乐蔚囊粋€(gè)重要方面，但目前此類臨床藥物少且具有毒副反應(yīng)。黃酮類化合物則被發(fā)現(xiàn)具有明顯的抑制血小板聚集的作用，對心腦血管疾病的防治具有一定療效［6-7］。

黃酮類化合物是一種天然多酚類植物化學(xué)物，具有多種生物學(xué)活性。其基本結(jié)構(gòu)由兩個(gè)苯環(huán)(A環(huán)和B環(huán))通過中央3個(gè)碳原子相互連接，也即具有C6-C3-C6骨架的一系列化合物［8-9］。根據(jù)取代基團(tuán)的不同可以分為黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮、二氫異黃酮等［10-12］。黃酮類化合物結(jié)構(gòu)上的差異會導(dǎo)致其生物學(xué)活性的變化［13-14］，其構(gòu)效關(guān)系的揭示對藥物的選用、開發(fā)和作用機(jī)制的研究具有重要意義。

本文系統(tǒng)研究了槲皮素(quercetin)、異槲皮素(isoquercitrin)、蘆丁(rutin)、橙皮素(hesperetin)、橙皮苷(hesperidin)、柚皮素(naringenin)、柚皮苷(naringin)和淫羊藿苷(icariin)(圖1)對ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的抑制作用，考察了黃酮類化合物不同取代基團(tuán)對血小板聚集的抑制作用，初步確定黃酮類化合物發(fā)揮血小板聚集抑制作用的重要功能基團(tuán)，為選擇有效的該類化合物用于心腦血管疾病的防治提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

圖1 8種黃酮化合物的結(jié)構(gòu)式Fig 1 The chemical structures of eight flavonoids

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

二磷酸腺苷(ADP)購于 Sigma公司，純度 ＞95%;其他試劑均為國產(chǎn)分析純;LBY-NJ4血小板聚集儀為北京普利生儀器有限公司產(chǎn)品;成年雌性SD大鼠購于大連醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。8種黃酮化合物均由大連工業(yè)大學(xué)魚紅閃教授提供。

1.2 8種黃酮化合物純度分析

8種黃酮化合物各稱取0.55 mg，分別用2 mL甲醇溶解，0.2 μm 過濾器過濾后，分別取 10 μL 樣品用Waters 2690/996高效液相色譜儀檢測其純度。色譜條件:Intersil ODS-3 C18色譜柱 (4.6 ×250 mm);流動(dòng)相:甲醇:0.2% 磷酸(60∶40);柱流速:1.0 mL/min;檢測波長:槲皮素、異槲皮素、蘆丁、柚皮素、柚皮苷為254 nm，橙皮素和橙皮苷為283 nm，淫羊藿苷為270 nm;柱溫25℃。

1.3 血小板聚集抑制實(shí)驗(yàn)

新鮮血標(biāo)本采自成年雌性SD大鼠，2周內(nèi)未服用任何藥物，空腹采集全血 20 mL，然后按 9∶1(血∶檸檬酸鈉)體積比加入3.8%檸檬酸鈉，800 rpm離心20 min，上清即為富含血小板血漿 (platelet rich plasma，PRP)，剩余部分在7000 rpm離心15 min，所得上清為缺乏血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)。取兩只比色杯，分別加入PPP和PRP各300 μL，置于LBY-NJ4血小板聚集儀中37℃預(yù)熱5 min。用PPP調(diào)零后測定PRP血小板數(shù)，將PRP與PPP混合使最終血小板數(shù)目為2.5×108/mL。在實(shí)驗(yàn)前將8種黃酮類植物化學(xué)物分別溶于DMSO中，終濃度為 331 μmol/L，與 450 μL 混合的血小板血漿在37℃溫育3 min，然后加入3 μL 30 μmol/L的ADP誘導(dǎo)鼠血小板聚集，記錄在60 s、180 s及300 s時(shí)的讀數(shù)。定義最大透過率為T0，此時(shí)的血小板的相對聚集程度(%)為100，加入黃酮類化合物后樣品的透過率T與之相比，按照公式(T0-T)/T0×100%，獲得血小板的相對聚集程度 (RPA，%)。對照組不加黃酮類化合物，處理方法與實(shí)驗(yàn)組相同。所有數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，差異檢驗(yàn)用方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 黃酮純度分析

通過計(jì)算槲皮素、蘆丁、異槲皮素、淫羊藿苷、橙皮素、橙皮苷、柚皮素和柚皮苷的HPLC峰面積和峰強(qiáng)度，8種物質(zhì)純度均超過95%(表1)，黃酮類化合物是高純度的，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度、準(zhǔn)確性。

表1 8種黃酮化合物的純度分析Tab 1 The purity determinations of eight flavonoids

2.2 黃酮對血小板聚集的抑制作用

不同種類的黃酮類化合物對血小板聚集的抑制作用不同。在相同濃度331 μmol/L時(shí)，8種黃酮類化合物對ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集均呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，與對照組(不加黃酮類化合物)相比，每一種黃酮類化合物對抑制血小板聚集程度的作用差異均有顯著性意義，P＜0.05。其抑制率作用依次為:槲皮素 (68.33±2.43)% ＞蘆丁(55.34 ±2.09)% ＞ 異槲皮素(52.27 ±4.65)% ＞橙皮素(50.80 ±7.03)% ＞ 橙皮苷(33.07 ±2.09)% ＞ 柚皮素(31.28 ±4.65)% ＞ 柚皮苷(22.91±1.68)% ＞淫羊藿苷(20.94 ±3.20)%(表2)。其中，異槲皮素和蘆丁、橙皮素之間對抑制血小板聚集作用差異無顯著性意義(P＞0.05);橙皮苷與柚皮素、柚皮苷與淫羊藿苷間對血小板聚集抑制作用也無顯著性差異(P＞0.05)。其余各組之間對血小板聚集抑制作用差異均有顯著性意義(P＜0.05)。

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3 討 論

黃酮類化合物抑制血小板聚集的作用機(jī)制目前還不是很清楚，可能通過抑制血小板活化、5-羥色胺釋放、血栓素A2(TxA2)形成、磷酸激酶C活化、Ca2+內(nèi)流和釋放以及阻斷TxA2受體等來抑制血小板聚集［2，3，5，7，13，15-16］，但其具體作用機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步深入研究。

黃酮類化合物酚羥基數(shù)目越多，其抗血小板作用可能越強(qiáng)［5，13-14］。8種黃酮類化合物中，槲皮素含有5個(gè)酚羥基，其酚羥基數(shù)目最多，槲皮素也呈現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制血小板聚集的能力。C環(huán)C3羥基對血小板聚集的抑制作用影響較大［5，13-14］。槲皮素與異槲皮素和蘆丁的結(jié)構(gòu)差異只在C環(huán)C3位的取代基不同，槲皮素為羥基，而異槲皮素和蘆丁分別為O-β-Gl和O-Glc-α-Rha糖苷基，由于C環(huán)C3位羥基的缺失，異槲皮素和蘆丁抑制血小板聚集的能力比槲皮素分別降低了～23.50%和～19.01%。結(jié)果表明:黃酮類化合物C環(huán)C3位羥基是發(fā)揮抑制血小板聚集功能的重要基團(tuán)。A環(huán)C7羥基也是影響血小板聚集的重要基團(tuán)［5，13-14］。橙皮素和橙皮苷、柚皮素和柚皮苷的結(jié)構(gòu)差異僅在A環(huán)C7基團(tuán)不同，橙皮素和柚皮素的A環(huán)C7羥基被雙糖苷基O-β-Glc-α-Rha取代之后，其抑制血小板聚集的能力比橙皮素和柚皮素分別降低了～26.76%和～34.90%。說明黃酮類化合物A環(huán)上的C7羥基也是抑制血小板聚集的功能基團(tuán)，其對抑制血小板聚集的貢獻(xiàn)度大于C環(huán)C3位羥基。異槲皮素、蘆丁和橙皮素抑制血小板聚集的作用相近，它們的結(jié)構(gòu)差別在C環(huán)C2-C3雙鍵結(jié)構(gòu)、B環(huán)3’-4’鄰位二羥基結(jié)構(gòu)上，異槲皮素和蘆丁C環(huán)為C2-C3雙鍵結(jié)構(gòu)而且具有3’-4’鄰位二羥基結(jié)構(gòu)，橙皮素C環(huán)C2-C3為單鍵，不具有3’-4’鄰位二羥基結(jié)構(gòu)。構(gòu)效關(guān)系表明:C環(huán)C2-C3雙鍵結(jié)構(gòu)和B環(huán)3’-4’鄰位二羥基結(jié)構(gòu)對血小板聚集作用影響不大。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，酚羥基數(shù)目、A環(huán)C7位羥基和C環(huán)C3位羥基均影響黃酮類化合物的抗血小板聚集活性。本實(shí)驗(yàn)為選擇有效的膳食黃酮類化合物防治心腦血管疾病及其應(yīng)用提供了一定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

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Structure-function study of flavonoid phytochemicals on platelet aggregation

GUO Yi-meng1，GUO Chun-mei2，LIU Shu-qing1，YU Hong-shan3，SUN Ming-zhong2
(1.Department of Biochemistry，Dalian Medical University，Dalian116044，China;2.Department of Biotechnology，Dalian Medical University，Dalian116044，China;3.School of Bioengineering，Dalian Polytechnic University，Dalian116034，China)

Abstract:［Objective］To compare the inhibitory effects of eight flavonoid phytochemicals on platelet aggregation and also explore the structure-function association.［Methods］The inhibitory effects of eight flavonoids on ADP-induced rat platelet aggregation were studied in vitro and obtained their inhibiting percentages.［Results］The results indicated that all the eight flavonoids including quercetin，rutin，isoquercitrin，hesperetin，naringenin，hesperidin，naringin and icariin could inhibit the ADP-induced rat platelet aggregation by(68.33 ±2.43)%，(55.34 ±2.09)%，(52.27 ±4.65)%，(50.80 ±7.03)%，(33.07 ±2.09)%，(31.28 ±4.65)%，(22.91 ±1.68)%and(20.94 ±3.20)%.［Conclusion］The apparent inhibitory effects of flavonoids on platelet aggregation are potentially associated with their intrinsic structures.The 7-OH group of A ring and 3-OH group of C ring were important for its antiplatelet function.

Key words:flavonoids;platelet aggregation;structure;function

Q956

A

1671-7295(2012)05-0424-04

國家自然科學(xué)基金(81100722，81171957);遼寧省教育廳科研項(xiàng)目(2008S077);遼寧省自然科學(xué)基金(20082158)

2012-03-26;

2012-08-14

郭一萌 (1983-)，女，山西太原人，研究生，碩士。E-mail:smzlsq@yahoo.com

孫明忠，教授，博士。E-mail:mxs288@gmail.com