宋 光，裘紅梅

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，遼寧大連 116622)

膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中TNF-α，IL-17及IL-10水平分析

宋 光，裘紅梅

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，遼寧大連 116622)

［目的］檢測(cè)血清TNF-α，IL-17及IL-10在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠血清中的表達(dá)。［方法］建立CIA動(dòng)物模型，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)大鼠模型血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-10及IL-17的水平，同時(shí)觀察大鼠炎癥指數(shù)。［結(jié)果］60只大鼠隨機(jī)被分為造模組(40只)和對(duì)照組(20只)，免疫4周后，造模組40只大鼠有32只發(fā)病。造模成功組大鼠血清中TNF-α、IL-17水平分別為(39.65±11.23)pg/mL和(46.1±10.9)pg/mL，明顯高于造模失敗組和正常對(duì)照組(P均＜0.05)，而IL-10水平(29.11±27.59)pg/mL明顯低于造模失敗組和正常對(duì)照組(P＜0.05)。另外，造模組大鼠血清TNF-α和IL-17水平與CIA大鼠炎癥指數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.573，r=0.492，P＜0.05)，與之相反，CIA大鼠血清 IL-10水平與炎癥指數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.481，P＜0.05)。［結(jié)論］致炎因子(TNF-α，IL-17)和抑炎因子(IL-10)表達(dá)失衡可能在CIA發(fā)病中具有重要作用。

膠原性關(guān)節(jié)炎;TNF-α;IL-17;IL-10;關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征，以慢性、對(duì)稱性、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的一種自身免疫性疾病。迄今為止RA發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但很多研究表明RA動(dòng)物模型在關(guān)節(jié)炎癥早期存在抑炎癥因子水平的降低及致炎癥因子水平的升高［1-2］，即炎癥因子的失衡與RA炎癥過程有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型，檢測(cè)其血清中TNF-α，IL-17和IL-10水平，并觀察其與炎癥指標(biāo)的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

Wistar大鼠60只，清潔級(jí)動(dòng)物，雌性，4～6周齡，體重為(160±15)g，購于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。許可證號(hào)為SCXK(遼)2002-0002?？ń槊?長(zhǎng)春生物制品研究所產(chǎn)品);羊毛脂(中國(guó)嘉定華亭羊毛脂廠產(chǎn)品);牛Ⅱ型膠原(typeⅡcollagen，CⅡ，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)。檢測(cè)大鼠血清中TNF-α，IL-17及IL-10水平的ElISA試劑盒(BioLegend公司)。

1.2 動(dòng)物造模

60只大鼠隨機(jī)分成兩組:模型組40只，正常對(duì)照組20只。具體造模如下:弗氏完全佐劑的配制［3］:將液體石蠟和羊毛脂(2∶1)于70℃水浴中充分混勻，高壓滅菌(121℃、30 min)制成弗氏不完全佐劑，4℃保存。使用時(shí)，將減毒卡介苗80℃ 滅活，與弗氏不完全佐劑混勻，制成弗氏完全佐劑，卡介苗的終濃度為10 mg/mL。將牛CII溶于0.05 mol/L乙酸，并與等體積弗氏完全佐劑混合制成混懸乳劑，CII終濃度2 mg/mL。造模組大鼠每只尾根部皮內(nèi)注射200 μL上述乳劑，1周后，每只大鼠接受加強(qiáng)免疫，尾根部皮內(nèi)注射乳化CII 100 μL，誘發(fā) CIA。對(duì)照組大鼠以相同劑量相同部位注射生理鹽水。

1.3 關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評(píng)定

采用關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)評(píng)分法記錄多發(fā)性關(guān)節(jié)炎病變的發(fā)生及嚴(yán)重程度，CIA關(guān)節(jié)炎癥的嚴(yán)重程度按照以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，分?jǐn)?shù)越高，病情越重。每個(gè)肢體最高分為4分，每只大鼠最高分為16分，記分標(biāo)準(zhǔn)分5級(jí)(0～4)，具體標(biāo)準(zhǔn)如下［4］:0分:無關(guān)節(jié)炎;1分:關(guān)節(jié)輕度腫脹;2分:關(guān)節(jié)部位中度腫脹;3分:嚴(yán)重腫脹;4分:嚴(yán)重腫脹且不能負(fù)重。

1.4 血清TNF-α、IL-17及IL-10水平的檢測(cè)

大鼠心臟采血，離心取上清-20℃保存?zhèn)溆?。檢測(cè)血清TNF-α、IL-10、IL-17水平，具體操作按ELISA試劑盒說明進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 一般觀察

正常對(duì)照組大鼠后腿，可觀察到其表面顯現(xiàn)正常的粉紅色，腳踝無腫脹，足趾不增厚。在免疫8～12 d后，模型組大鼠開始出現(xiàn)癥狀。發(fā)病大鼠后腿可見腳踝明顯腫脹，足趾明顯增厚，整個(gè)后腳呈現(xiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)。嚴(yán)重者可見紫色，且行走不便，不能負(fù)重。紅腫逐漸消退逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形以至功能障礙，表明慢性、對(duì)稱性、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生。40只免疫大鼠中，有32只發(fā)病明顯;而對(duì)照無發(fā)病大鼠。發(fā)病大鼠活動(dòng)量明顯減少，食欲下降，體重低于正常組。

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評(píng)定

造模成功組關(guān)節(jié)炎指數(shù)與對(duì)照組和造模失敗組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。關(guān)節(jié)炎指數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，免疫4周及3周較免疫后10 d關(guān)節(jié)炎癥更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表 1。

表1 不同組大鼠炎癥指數(shù)的比較Tab 1 The comparison of inflammatory index in rats from different groups (±s)

表1 不同組大鼠炎癥指數(shù)的比較Tab 1 The comparison of inflammatory index in rats from different groups (±s)

1)與免疫3周及4周時(shí)比較，P＜0.05;2)與造模失敗組及正常對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 n 免疫后10 d 免疫3周 免疫4周造模成功組 32 4.5 ±2.11)2)9.6 ±2.3 10.4 ±1.2造模失敗組 8 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0正常對(duì)照組20 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0

2.3 各組大鼠血清細(xì)胞因子水平的測(cè)定

在免疫后的第4周，大鼠心臟穿刺采血，離心取上清，檢測(cè)大鼠血清TNF-α，IL-17和IL-10的表達(dá)水平。與造模失敗及正常對(duì)照組相比，造模成功組大鼠血清中TNF-α，IL-17的水平顯著增高(P＜0.05);IL - 10水平明顯降低(P ＜0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠血清TNF-α，IL-17和IL-10水平的比較Tab 2 the comparison of TNF-α，IL-17 and IL-10 in rats serum from different groups (±s)

表2 兩組大鼠血清TNF-α，IL-17和IL-10水平的比較Tab 2 the comparison of TNF-α，IL-17 and IL-10 in rats serum from different groups (±s)

1)與造模失敗組及正常對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 TNF-α(pg/mL) IL-17(pg/mL) IL-10(pg/mL)造模成功組 39.65 ±11.231) 46.1 ±10.91) 29.11 ±27.591)造模失敗組 14.33 ±4.78 5.1 ±1.2 58.78 ±15.75正常對(duì)照組10.49 ±8.53 4.2 ±1.6 59.00 ±16.85

2.4 CIA大鼠血清TNF-α，IL-17和IL-10水平與炎癥指數(shù)的相關(guān)性分析

免疫4周后，造模組大鼠血清TNF-α和IL-17水平與CIA大鼠炎癥指數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.573，r=0.492，P 均 ＜0.05)，與之相反，CIA 大鼠血清IL-10水平與炎癥指數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.481，P ＜0.05)。

3 討 論

RA是以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，致殘率高?；静±砀淖兪腔ぱ缀脱荇栊纬杉把褰M織中多種細(xì)胞因子及黏附分子等變化。其中細(xì)胞因子異常產(chǎn)生及其相互作用在RA關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞過程中起重要作用。細(xì)胞因子根據(jù)其性質(zhì)可分為兩大類，即促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子。在正常情況下，促炎因子和抑炎因子處于一個(gè)平衡狀態(tài)，如有外界原因使促炎因子增加而抑炎因子的分泌減少，打破這種平衡，則會(huì)引發(fā)關(guān)節(jié)炎癥。RA患者外周血單核細(xì)胞和關(guān)節(jié)滑膜液的巨噬細(xì)胞能分泌TNF-α，在關(guān)節(jié)炎癥、滑膜新生血管形成及骨質(zhì)破壞等病變發(fā)展中起主要作用。研究表明，TNF-α能啟動(dòng)和維持RA炎癥免疫，在RA發(fā)病中起著中心環(huán)節(jié)的作用［5］。TNF-α單克隆抗體已經(jīng)成功應(yīng)用于RA患者。IL-17主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)滑膜細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的致炎作用能刺激成纖維細(xì)胞分泌 IL-6、IL-8、GM -CSF等炎癥因子［6］。抑制軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，與TNF-α協(xié)同參與骨侵蝕。IL-10是重要抗炎TH2型細(xì)胞因子，通過抑制核因子κB進(jìn)而抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生TNF -α、IL -2、IFN -γ［7］;可下調(diào)抗原遞呈細(xì)胞功能，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶生成，抑制IL-17等致炎因子的功能和生成，從而抑制RA關(guān)節(jié)炎炎癥，控制或阻止軟骨及骨的破壞。

由Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型是研究人類RA的常用模型，本實(shí)驗(yàn)40只造膜組大鼠有32只關(guān)節(jié)腫脹程度嚴(yán)重，隨著時(shí)間的推移炎癥指標(biāo)逐漸加重，說明造模成功。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)炎大鼠血清中致炎因子TNF-α、IL-17明顯升高;抑炎因子IL-10表達(dá)顯著受抑;并且增高的TNF-α和IL-17與炎癥指數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，而降低的IL-10水平與炎癥指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，說明關(guān)節(jié)炎大鼠發(fā)病過程中，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)發(fā)揮重要作用，并與炎癥發(fā)病有關(guān)。本研究提示對(duì)細(xì)胞因子深入研究將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)RA的發(fā)生機(jī)制，合理地評(píng)價(jià)RA的病情進(jìn)展，為RA的免疫治療提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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［1］周厚清，吳瑾濱，董敏.類風(fēng)濕因子陰性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清抗瓜氨酸肽或蛋白抗體、IL-10及IL-18檢測(cè)分析［J］.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32(13):1441-1442.

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Analysis of TNF-α，IL-17 and IL-10 levels in the serum of rats with collagen-induced arthritis

SONG Guang，QIU Hong-mei
(Medical Laboratory Technology，Dalian University Medical School，Dalian116622，China)

Abstract:［Objective］To investigate the serum levels of TNF-α，IL-17 and IL-10 in rats with type II collagen-induced arthritis(CIA).［Methods］The rat model was established using type II collagen and the serum levels of TNF - α，IL-17 and IL-10 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The arthritis index in CIA rats were observed.［Results］Sixty rats were randomized into two groups:modeling group(40 rats)and normal control(20 rats).After 4 weeks，the models of CIA were established in 32 rats.The serum levels of TNF-α and IL-17 in the successful modeling group were(39.65 ± 11.23)pg/mL and(46.1 ± 10.9)pg/mL，respectively，significantly higher than that in the abortive modeling group and normal control.While serum concentration of IL -10(29.11 ±27.59)pg/mL in the successful modeling group was remarkably lower than that in the abortive modeling group and normal control(P＜0.05).In addition，There were positive correlations between TNF - α，IL -17 and arthritis index(r=0.573，r=0.492，P＜0.05)，negative correlations between IL -10 and arthritis index in CIA rats(r= -0.481，P＜0.05).［Conclusion］The imbalance of pro- inflammatory cytokine(TNF-α，IL-17)and anti-inflammatory cytokine(IL-10)network may be playing an important role in the pathogenesis of CIA.

Key words:collagen-induced arthritis;TNF-α;IL-17;IL-10;arthritis index

R392-33

A

1671-7295(2012)05-0492-03

遼寧省高等學(xué)校科研項(xiàng)目計(jì)劃(L2010021)

2012-06-13;

2012-09-09

宋 光(1970-)，女，講師，碩士。

裘紅梅，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士。E-mail:yxyqhm@126.com