廖碧釵

(1.福建省淡水水產(chǎn)研究所 福建福州 350002;2.福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站)

1 前言

阿苯達(dá)唑(albendazole，ABZ)是一種廣譜抗寄生蟲(chóng)藥，作用強(qiáng)、毒性小，對(duì)許多動(dòng)物如羊、豬、家禽等的胃腸道線蟲(chóng)、絳蟲(chóng)等有很好的療效［1－3］，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要用于鰻鱺蠕蟲(chóng)病的治療［4，5］。ABZ進(jìn)入體內(nèi)以后，在肝微粒體藥酶和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的作用下，轉(zhuǎn)化成阿苯達(dá)唑亞砜(a1bendazole sulphoxide，ABZSO)，是治療囊蟲(chóng)病的有效成分，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成砜(albendazole sulphone，ABZSO2)而失活，最終變成2－氨基砜排出體外［6］。ABZ及其代謝物在試驗(yàn)動(dòng)物安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)中表現(xiàn)出致畸和肝臟毒性［7］，因此成為動(dòng)物性食品獸藥殘留的重要監(jiān)控對(duì)象。國(guó)內(nèi)外對(duì)ABZ及其代謝物在人、羊等動(dòng)物體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)已有研究［8，9］，但在鰻鱺體內(nèi)的藥動(dòng)及殘留研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在了解ABZ及其代謝物在歐洲鰻鱺體內(nèi)的分布及殘留消除規(guī)律，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)，購(gòu)自龍巖三華養(yǎng)鰻場(chǎng)，平均體重(100±10)g，試驗(yàn)前3 d停止喂食，水溫控制(25±2)℃;經(jīng)抽查試驗(yàn)用歐洲鰻鱺組織中均不含ABZ及其代謝物。

2.1.2 藥品及試劑

ABZ標(biāo)準(zhǔn)品(含量99%)，購(gòu)于德國(guó)DR.Ehrenstorfer公司;ABZSO標(biāo)準(zhǔn)品(含量99%)和ABZSO2標(biāo)準(zhǔn)品(含量98.5%)，購(gòu)于德國(guó)Witega公司;ABZ原料藥(含量89%)，購(gòu)于陜西漢江制藥有限公司;乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

ABZ母液:準(zhǔn)確稱(chēng)取ABZ原料藥2 g，置于100 mL容量瓶中，加10 mL冰乙酸溶解，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為20 g/L的ABZ母液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

ABZ及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)貯備液:分別準(zhǔn)確稱(chēng)取ABZ、ABZSO和 ABZSO2標(biāo)準(zhǔn)品 10 mg，分別置于100 mL容量瓶中，用少許冰乙酸助溶，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為100 mg/L的ABZ及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀;XW－80A微型旋渦混合儀;飛鴿DL－5C離心機(jī)。

2.2 方法

2.2.1 色譜條件

色譜柱為SB－C18(4.6×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈:1%醋酸溶液，梯度洗脫程序見(jiàn)表1;檢測(cè)波長(zhǎng)為294 nm;進(jìn)樣量50μL;柱溫25℃。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 給藥方法及采樣

試驗(yàn)用歐洲鰻鱺約300尾，隨機(jī)等量分裝至水族箱進(jìn)行試驗(yàn)，每箱放曝氣24 h以上的自來(lái)水150 L。給藥時(shí)在每箱中各加15 mL ABZ母液，使水體終濃度為2 mg/L，浸浴36 h后徹底換水。給藥后0.5、1、1.5、2、3、5、7、12、24、36、48、72、144、216、288、432、720、1440 和 2160 h 分別采集魚(yú)樣 10 尾，采血后用無(wú)污染的小刀割取背脊兩側(cè)肌肉，并迅速將皮剝離，依次放入標(biāo)記好的樣品袋中，每2尾為1組;樣品置－20℃冷凍貯存，備用。

2.2.3 樣品前處理

2.2.3.1 血漿樣品的提取

取1.0 mL血漿，加1 mLNa2CO3溶液(2 mol/L)和6 mL二氯甲烷旋渦混合15 min，5000 r/min離心10 min，取上清液，置40℃水浴中氮?dú)饬鞔蹈?。?.0 mL 45%乙腈水溶液溶解殘留物，過(guò)0.45μm濾膜，定容至1.0 mL，HPLC 測(cè)定。

2.2.3.2 肌肉樣品的提取

取2.0 g勻漿肌肉組織，加2 mL Na2CO3溶液(2 mol/L)和12 mL二氯甲烷旋渦混合15 min，5000 r/min離心10 min。取上清液，置40℃水浴中氮?dú)饬鞔蹈?。?.0 mL 45%乙腈水溶液溶解殘留物，旋渦混合2 min，超聲波提取5 min。加入乙腈水飽和正己烷6 mL，旋渦混合1 min，5000 r/min離心2 min。棄去正己烷層，下層液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，定容至1.0 mL，HPLC 測(cè)定。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

于1.0 mL血漿和2.0 g勻漿肌肉樣品中加入不同體積ABZ及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)貯備液，制成含標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 0.01、0.05、0.10、0.5、1.0、5.0 和 10.0 mg/L(kg)的樣品溶液，按2.2.3的方法對(duì)樣品處理后測(cè)定其峰面積，求出血漿和肌肉的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2.2.5 回收率和精密度測(cè)定

取血漿和勻漿肌肉組織，加入ABZ及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，制成0.05、0.5 和 5.0 mg/L(kg)3個(gè)濃度的樣品溶液。按2.2.3的方法處理，取50 μL進(jìn)行HPLC測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次，記錄峰面積，計(jì)算其回收率。

將上述樣品每個(gè)濃度日內(nèi)測(cè)定5次，日間測(cè)5次，計(jì)算樣品中藥物濃度的日內(nèi)、日間變異系數(shù)。

2.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用PKS藥代動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行模型擬合和參數(shù)計(jì)算;消除方程、休藥期計(jì)算采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算。

2.2.7 休藥期計(jì)算

ABZ及其代謝物是按一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程從體內(nèi)消除，即在消除后期服從指數(shù)消除:C=C0e－ket，根據(jù)消除后期測(cè)定的組織藥物濃度及規(guī)定的最高殘留限量(MRL)，計(jì)算各組織藥物濃度降至規(guī)定水平所需的時(shí)間(WDT):

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜行為及標(biāo)準(zhǔn)曲線

在2.2.1色譜條件下，各物質(zhì)分離完全，峰形對(duì)稱(chēng)，保留時(shí)間穩(wěn)定(圖1)。在0.01－10 mg/L(kg)線性范圍內(nèi)，血漿和肌肉中ABZ及其代謝物的添加標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表2，其線性關(guān)系良好。

圖1 ABZ及其代謝物在歐洲鰻鱺體內(nèi)的色譜圖

表2 ABZ及其代謝物在歐洲鰻鱺血漿和肌肉中的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

3.2 回收率和精密度

以信噪比(S/N)為3計(jì)算，本方法測(cè)定ABZ及其代謝物的最低檢測(cè)限均為3μg/L，回收率均達(dá)74%以上，平均變異系數(shù)均低于6.71%，說(shuō)明該方法回收率高、重復(fù)性好，詳見(jiàn)表3。

表3 歐洲鰻鱺血漿和肌肉中ABZ及其代謝物的回收率和精密度

3.3 藥代動(dòng)力學(xué)

歐洲鰻鱺以2 mg/kg的劑量浸浴ABZ 36h后，ABZ的血藥濃度在12 h達(dá)到最高值3.623 mg/L，144 h后不能檢出;ABZSO的血藥濃度在24 h達(dá)到最高值7.423 mg/L，1440 h后不能檢出;ABZSO2的血藥濃度在36 h達(dá)到最高值1.829 mg/L，432 h后不能檢出。藥物在血漿中的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)如表4所示，經(jīng)房室模型分析，ABZ和ABZSO的血藥濃度時(shí)間數(shù)據(jù)符合一級(jí)吸收二室開(kāi)放模型，ABZSO2的血藥濃度時(shí)間數(shù)據(jù)符合一級(jí)吸收一室開(kāi)放模型，其藥 動(dòng) 學(xué) 方 程 分 別 為:C = － 16.185e－0.160t+14.756e－0.098t+1.429e－0.020t、C= － 8.371e－0.184t+7.797e－0.009t+0.574e－0.007t和 C=7.925(e－0.015t－e－0.027t)，平均藥時(shí)曲線見(jiàn)圖 2。

表4 ABZ及其代謝物在歐洲鰻鱺血漿中的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖2 ABZ及其代謝物在歐洲鰻鱺血漿中的藥時(shí)曲線

3.4 藥物消除規(guī)律

歐洲鰻鱺浸浴ABZ 12 h后，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)處理得到血漿和肌肉組織中藥物濃度(C)與時(shí)間(t)關(guān)系的消除曲線方程、相關(guān)指數(shù)(R2)及消除半衰期(T1/2)見(jiàn)表5，可知藥物在血漿和肌肉中消除較緩慢。

表5 ABZ及其代謝物在歐洲鰻鱺血漿和肌肉組織中的消除曲線方程及參數(shù)

3.5 休藥期

我國(guó)1999年發(fā)布的235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定動(dòng)物肌肉中ABZ的總殘留量為100μg/kg，通過(guò)休藥期公式計(jì)算可知肌肉組織中ABZ、ABZSO和ABZSO2的理論休藥期分別為 7.34d、22.65d 和 13.98d。因此在本試驗(yàn)條件下，建議ABZ在歐洲鰻鱺體內(nèi)的休藥期為23d。

4 討論

本試驗(yàn)比較了不同緩沖液和提取劑對(duì)血漿和肌肉中ABZ及其代謝物的回收率。在本試驗(yàn)條件下用磷酸鹽緩沖液(pH7.4)和其他提取劑提取ABZ及其代謝物，ABZSO和ABZSO2的回收率都能達(dá)到80%左右，而ABZ的回收率很低(僅15%左右);當(dāng)用Na2CO3溶液(2 mol/L)和其他提取劑提取時(shí)，ABZ及其代謝物的回收率均能達(dá)到70%以上;而用Na2CO3溶液(2 mol/L)和二氯甲烷作為提取劑，其回收率相對(duì)較高。說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下，ABZ更易在堿性較高的溶液中溶于二氯甲烷。

研究表明，ABZ在動(dòng)物體內(nèi)僅作為“前體性藥物”，其原型藥作用很小，主要作用是由它在機(jī)體內(nèi)的代謝產(chǎn)物ABZSO來(lái)完成。ABZSO是ABZ發(fā)揮作用的活性物質(zhì)［10，11］，2 － 氨基砜是 ABZ 的最終代謝物，無(wú)驅(qū)蟲(chóng)活性，僅在動(dòng)物的尿中可發(fā)現(xiàn)［12］。因此本方法未將2－氨基砜列入殘留檢測(cè)對(duì)象。Averkin等比較了ABZ及ABZSO、ABZSO2代謝物的驅(qū)蠕蟲(chóng)活性，發(fā)現(xiàn)在鼠體內(nèi)ABZSO比ABZ的驅(qū)蟲(chóng)活性要強(qiáng)，而ABZSO2幾乎無(wú)驅(qū)蟲(chóng)作用［13］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，浸浴給藥后，ABZ在歐洲鰻鱺血漿中僅以少量存在，它在鰻鱺體內(nèi)迅速、廣泛地被代謝為ABZSO及少量的ABZSO2，這與其在人體與其他動(dòng)物體內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果相一致［14－18］。從藥動(dòng)學(xué)參數(shù)來(lái)看，浸浴ABZ后，ABZSO在血漿中的吸收速率常數(shù)較大，消除速率常數(shù)較小，AUC值大，說(shuō)明ABZSO在鰻鱺體內(nèi)能迅速吸收且消除緩慢，能發(fā)揮較好的驅(qū)蟲(chóng)作用。

農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中限量規(guī)定的是ABZ及其代謝物的總殘留量，在本試驗(yàn)條件下，ABZ和ABZSO2分別在給藥后144h和432h就不能檢出，因此，以ABZSO殘留量代表總量作為該藥在鰻鱺體內(nèi)的休藥期。但是，魚(yú)體內(nèi)的藥物消除受許多因素影響，所以臨床休藥期要根據(jù)具體魚(yú)種、實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境分別進(jìn)行研究確定。

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