賴心田 劉小青 洪曉明 陳國培 楊國武

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院 廣東深圳 518131)

1 前言

近十幾年來，隨著轉(zhuǎn)基因作物及其加工產(chǎn)品在數(shù)量和應(yīng)用上的逐漸增多，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其安全性受到了越來越多的關(guān)注［1］，同時(shí)也給轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管工作帶來更大的挑戰(zhàn)。不少國家已經(jīng)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行了限量標(biāo)識(shí)管理，我國也建立了轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)識(shí)管理目錄，并納入了檢驗(yàn)檢疫和質(zhì)檢部門的檢測(cè)項(xiàng)目。

目前轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)主要是采用普通PCR和單重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行，然而隨著TaqMan探針技術(shù)的發(fā)展［2，3］，多重定量 PCR不僅能節(jié)省樣品及試劑，同時(shí)也能實(shí)現(xiàn)一管多檢的高效率［4－6］。此外，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的PCR檢測(cè)使用重組質(zhì)粒，可以長期穩(wěn)定保存并與目的基因保持較高同源性，因此，將檢測(cè)的目的基因片段克隆到質(zhì)粒載體中制備成陽性參照物，不僅可以使陽性參照物長期穩(wěn)定保存，而且使檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性得到很大的提高［7］。

由于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆外源基因的檢測(cè)包括3個(gè)部分:花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子、胭脂堿合成酶的NOS終止子以及5－烯醇丙酮酸莽草酸 －3 － 磷酸合成酶基因 CP4 EPSPS［8］，因此，本研究旨在構(gòu)建穩(wěn)定、可靠、易制備和保存的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆陽性標(biāo)準(zhǔn)分子，建立抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)一次PCR反應(yīng)完成篩選和特異性檢測(cè)的過程。

2 材料與方法

2.1 材料

轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆標(biāo)準(zhǔn)品為美國孟山都公司的RRS轉(zhuǎn)基因大豆GTS40－3－2。實(shí)驗(yàn)所用的PCR引物和熒光探針由上海生工生物工程公司合成和標(biāo)記，所用的分子生物學(xué)試劑均購自大連寶生物生物工程公司。

2.2 方法

2.2.1 RRS 外源基因片段克隆

取適量RRS轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品，研磨成粉狀，采用CTAB法提取大豆基因組，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其含量，并稀釋至50ng/μL作為PCR擴(kuò)增模板。在PCR擴(kuò)增中，利用連接引物、CaMV35S、CP4 EPSPS和NOS引物將3個(gè)外源基因片段串聯(lián)在一起并克隆至PMD－18T載體上，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為PMD18T/SOY，并送上海生工測(cè)序。構(gòu)建及檢測(cè)中用到的引物［9］如表1所示。

表1 引物表

2.2.2 三重實(shí)時(shí)熒光PCR體系構(gòu)建

CaMV35S，CP4 EPSPS，NOS 的熒光引物和探針序列［10］見表2。提取上述構(gòu)建好的 PMD18T/SOY質(zhì)粒，并用RNAse消化RNA后稀釋至10ng為模板，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，進(jìn)行三重?zé)晒釶CR，引物和探針濃度均為20mmol/μL，通過調(diào)整Mg2+，酶的濃度，引物和探針的量，最終獲得25μL如下的三重?zé)晒獾捏w系:2.5μL 10 × r － taq buffer，3μL dNTP 2ulMg2+，13.3μL ddH2O，0.4μL 各引物，0.2μL 各探針，0.2 μL r－ taq 酶，1μL 10ng/μL 質(zhì)粒。熒光PCR的反應(yīng)條件為:95℃，3min;95℃，15s;60℃，34s;40cycle。

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR引物及探針表

2.2.3 三重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)限值測(cè)定

以10ng/μL的PMD18T/SOY質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，質(zhì)粒濃度分別為 10、1、10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6ng/μL，采用 25μL 體系，體系同2.2.2，同時(shí)做陰性空白對(duì)照，進(jìn)行三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)限值的測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 RRS外源基因片段克隆

通過設(shè)計(jì)的中間引物，將抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的CaMV35S、CP4 EPSPS和NOS 3個(gè)外源基因融合在一起，采用CaMV35S正向引物和NOS反向引物，以PMD18T/SOY質(zhì)粒為模板經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物擴(kuò)增片段堿基理論長度應(yīng)為549bp，檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 PMD18T/SOY檢測(cè)結(jié)果

圖1 顯示，擴(kuò)增條帶大小約為550bp，與理論長度一致。PMD18T/SOY質(zhì)粒插入片斷經(jīng)測(cè)序分析與標(biāo)準(zhǔn)序列一致，證實(shí)PMD18T/SOY構(gòu)建成功，可用于轉(zhuǎn)基因定性檢測(cè)及限值檢測(cè)的陽性參照物。

3.2 三重實(shí)時(shí)熒光PCR體系建立及檢測(cè)限值的測(cè)定

經(jīng)過調(diào)整Mg2+、酶的濃度、引物和探針的量獲得大于90%的高擴(kuò)增效率和重復(fù)性一致的三重?zé)晒釶CR體系，采用構(gòu)建好的 PMD18T/SOY質(zhì)粒10ng為模板，獲得的結(jié)果如圖2所示。

圖2 三重?zé)晒釶CR檢測(cè)結(jié)果

從圖2中可看出，CaMV35S、CP4 EPSPS和NOS的Ct值接近，空白無污染，建立的三重?zé)晒釶CR體系適合對(duì)以該質(zhì)粒為陽性參照進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因定性檢測(cè)。此外，以10ng/μL的質(zhì)粒為母液，并進(jìn)行10倍梯度稀釋進(jìn)行CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS三重?zé)晒釶CR檢測(cè)限值分析，擴(kuò)增曲線見圖3。以質(zhì)粒濃度的log值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，建立擴(kuò)增基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見圖4。

圖3 三重?zé)晒釶CR CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS檢測(cè)限值測(cè)定結(jié)果

圖4 三重?zé)晒釶CR CaMV35S、NOS、CP4 EPSPS基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 和圖4顯示，3個(gè)基因的熒光PCR每個(gè)循環(huán)呈等差的3－4Ct值增加，Ct值介于13－30之間，且這3個(gè)基因的熒光PCR檢測(cè)限值均為10－3ng/μL，即能檢測(cè)到1pg的DNA，靈敏度特別高。并且圖4中CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS的r2值分別為0.998、0.999、0.999，這也說明梯度稀釋的質(zhì)粒模板擴(kuò)增線性相關(guān)性非常好。

4 討論

使用PMD18T/SOY作為參比分子時(shí)，構(gòu)建的多重?zé)晒舛縋CR體系靈敏度極高，可對(duì)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。但是，高靈敏度的同時(shí)也帶來一定的風(fēng)險(xiǎn)性，如果有微量轉(zhuǎn)基因物質(zhì)氣溶膠存在，則很容易造成污染，使空白在Ct值為30多時(shí)有峰揚(yáng)起，因此，需嚴(yán)格控制熒光定量PCR體系配制區(qū)與模板加樣區(qū)的隔離，避免氣溶膠等的存在，從而避免出現(xiàn)假陽性。

歐盟聯(lián)合研究中心標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM或者ERM)提供的抗草甘磷轉(zhuǎn)基因大豆GTS40－3－2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是 5%、2%、1%、0.5%、0.1%和0%6個(gè)濃度梯度的種子粉末，由于不同種子在提取的DNA質(zhì)量、純度和復(fù)雜程度上很難保持一致，容易導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率的差異，這都會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分定量分析的準(zhǔn)確度產(chǎn)生一定的影響。此外，種子作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)重復(fù)性難以控制，線性相關(guān)性也較差。在本研究中，將融合了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的CaMV35S、CP4 EPSPS和NOS 3個(gè)外源基因的質(zhì)粒PMD18T/SOY作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分子，并在此基礎(chǔ)上建立多重?zé)晒釶CR，實(shí)現(xiàn)一管多檢，定量檢測(cè)未知樣品時(shí)可稀釋到10－6，檢測(cè)限值達(dá)10－3ng/μL，線性關(guān)系良好且范圍寬，作為參比分子非常精確，在建立的多重?zé)晒釶CR中，它的r2均在0.998以上。同時(shí)，作為標(biāo)準(zhǔn)分子的質(zhì)?？梢酝ㄟ^微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，DNA易于擴(kuò)增，可提供無限穩(wěn)定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分子可以同時(shí)包含多個(gè)外源目的基因，并且純度較高。因此與常規(guī)的從生物公司購買標(biāo)準(zhǔn)品相比，此方案更具有操作性，更能保證目的片段的擴(kuò)增效率，降低了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的成本。

［1］ 陳穎，徐寶梁，王曙光，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)中的應(yīng)用研究［J］.作物學(xué)報(bào)，2004，30(6):602－607.

［2］ 朱元招，尹靖東，王鳳來，等.抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆PCR定量檢測(cè)研究［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，10(3):25－29.

［3］ 譚帥.轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)概述［J］.大眾商務(wù)，2009，5:206.

［4］ 陳碧華，張建偉，王廣印，等.轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展Ⅱ.檢測(cè)技術(shù)的分類、比較、應(yīng)用及檢測(cè)步驟［J］.食品科學(xué)，2008，29(11):705 －711.

［5］ 曹澤鴻.轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法［J］.中國食品添加劑，2005，4:100－105.

［6］ 趙錦，鄧平建，劉建軍，等.轉(zhuǎn)基因食品多重定性PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2004，14(4):412 －414.

［7］ Burns M，Corbisier P，Wiseman G，et al.Comparison of plasmid and genomic DNA calibrants for the quantification of genetically modified ingredients［J］.Eur Food Res Technol，2006，224(2):249－258.

［8］ 陳碧華，張建偉，王廣印，等.轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展Ⅰ.主要檢測(cè)技術(shù)及其特點(diǎn)［J］.食品科學(xué)，2008，29(10):698－705.

［9］ SN/T 1195－2003大豆中轉(zhuǎn)基因成分的定性 PCR檢測(cè)方法［S］.

［10］ SN/T 1204－2003植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法［S］.