李琳，李海梅，何勝華，馬鶯

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

蛋白酶和纖維素酶協(xié)同水解豆渣的工藝

李琳，李海梅，何勝華，馬鶯*

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

采用堿性蛋白酶和纖維素酶協(xié)同水解豆渣制備發(fā)酵基料，并分析豆渣酶解液的成分。結(jié)果表明，豆渣與水以1∶4（質(zhì)量比）的比例混合，調(diào)節(jié)豆渣液pH 7.0，添加堿性蛋白酶6000 U/g同時加入纖維素酶1.5%（以豆渣干重計），55℃水解4 h后，可用作發(fā)酵培養(yǎng)基制備豆渣發(fā)酵活性成分。

豆渣；水解；蛋白酶；纖維素酶

Abstract:The producing method of hydrolysates of soybean dregs were studied.Soybean dregs were dilluted with distilled water at 1∶4(weight ratio).After adjusted solution pH 7.0,hydrolyzed by 6000 U/g alcalase and 1.5%cellulase(dry soybean dregs)for 4 h at 55℃,the hydolysate can be used fertimentation culture for producing active ingredient.

Key words：soybean dregs;hydrolysation;protase;cellulase

豆渣是大豆分離蛋白、豆腐等大豆制品加工中的主要副產(chǎn)物，約占全豆干重的15%~20%。豆渣中碳水化合物含有約60%~70%的纖維素和15%~20%的蛋白質(zhì)，以及多種微量元素和礦物質(zhì)[1]。豆渣由于纖維含量高，纖維顆粒大，口感粗糙，同時還含有抗胰蛋白酶、皂素和血凝素等抗?fàn)I養(yǎng)因子，不易被人體消化吸收，而且豆渣還含有令人難以接受的豆腥味。因此，作為食品原料的利用率較低，大多作為飼料和垃圾處理[2-3]。

采用選擇性蛋白酶或者微生物發(fā)酵法可以制備多種性能的膳食性活性肽[4-5]，如降血壓肽、降膽固醇活性肽、抗氧化肽、免疫調(diào)節(jié)肽、促進礦物質(zhì)吸收等低分子（2個~9個氨基酸）和中等鏈長（20個氨基酸左右）的活性肽[6-7]。通過微生物和酶的作用可把豆渣中的膳食纖維微粒化，部分不溶性膳食纖維降解為水溶性多糖，增加可食纖維量，消除豆渣的粗澀感以及豆腥味，有效地改善大豆膳食纖維的功能性和應(yīng)用價值[8-9]。

大豆膳食纖維和大豆活性肽是重要的食品工業(yè)原料和食品補充劑[10-11]，擬采用蛋白酶和纖維素酶協(xié)同水解豆渣作為霉菌發(fā)酵的底物[12]，研究確定酶解反應(yīng)的適宜條件，為后續(xù)微生物生長提供適宜的底物。

1 材料與方法

1.1 材料

豆渣：哈高科大豆食品有限責(zé)任公司提供。

Alcalase2.4 LFG：諾維信（中國）產(chǎn)品，活力 2.6×105U/m L；風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme500MG）：諾維信中國公司，活力5×104U/g；纖維素分解酶（工業(yè)應(yīng)用）：諾維信中國公司；濾紙酶活2000 U/g。

1.2 儀器

754PC型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；FA1104型電子天平：上海精密儀器公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-3C型精密PH計：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

豆渣成分分析方法：水分含量GB/T 5009.3-2003《食品中水分的測定》；灰分含量GB/T 5009.4-2003《食品中灰分的測定》；蛋白質(zhì)含量GB/T 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》；脂肪含量GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》；淀粉含量GB/T 5009.9-2003《食品中淀粉的測定》。大豆蛋白水解度的測定方法茚三酮法。纖維素酶水解液測定DNS法。

底物濃度：由于豆渣酶解液是用于霉菌發(fā)酵的底物，根據(jù)豆渣在水中溶解特性，豆渣加水過多，酶解液濃度太低，對后續(xù)發(fā)酵液處理工藝不利，豆渣與水比例過小，酶解反應(yīng)以及后續(xù)發(fā)酵時物料的傳遞性能差，既不利于酶解反應(yīng)，同時對后續(xù)霉菌發(fā)酵過程也不利，通過預(yù)備試驗驗證，以濕豆渣與水比例為1∶4最佳，故在研究酶解時均以此比例進行研究。

豆渣和水（1∶4，質(zhì)量比）室溫下混合，首先調(diào)節(jié)pH至需要值，然后添加一定量的酶，在特定溫度下水解某一時間后，高溫滅酶，在離心機中8000 r/min離心10 min，得豆渣酶解液和未水解殘渣供分析使用。

1.3.1 蛋白酶酶解條件的研究

主要研究酶的用量和酶解反應(yīng)時間等條件對蛋白水解度的影響。尋求水解度DH＜10%，且苦味最低的最優(yōu)酶解條件。

試驗選用的兩種蛋白酶的最適合溫度和最佳pH參考酶產(chǎn)品的說明書最佳使用條件選擇?？紤]到后續(xù)工藝中將采用蛋白酶與纖維素酶同時對豆渣進行水解，因此，兼顧纖維素酶的最佳使用條件，兩種蛋白酶酶解豆渣中蛋白質(zhì)的工藝條件確定為：反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)pH 7.0。

1.3.2 纖維素酶酶解條件的研究

在研究纖維素酶的使用條件時，同樣需要考慮所選用的蛋白酶的使用條件，統(tǒng)籌考慮來確定纖維素酶的水解條件。豆渣和水（1∶4，質(zhì)量比）室溫下混合，調(diào)節(jié)pH 7.0，添加一定量纖維素酶，溫度55℃下水解一定時間后，滅酶，8000 r/min離心10 min，得豆渣纖維素酶解液。主要研究加酶量與酶解反應(yīng)時間對豆渣纖維水解的影響。

1.3.3 雙酶（蛋白酶和纖維素酶）混合水解豆渣條件的優(yōu)選

在本研究中，豆渣進行蛋白酶和纖維素酶水解的主要目的是為微生物發(fā)酵提供易于利用的營養(yǎng)物質(zhì)，即酶解液中應(yīng)含有單糖、氨基酸等小分子化合物。因此，只要能滿足這一基本要求，酶解工藝應(yīng)盡可能簡單，這對工業(yè)化生產(chǎn)意義重大。

以豆渣為底物，研究蛋白酶和纖維素酶協(xié)同水解大豆蛋白和大豆纖維工藝條件時，擬將兩種酶同時加入反應(yīng)液中進行反應(yīng)。這可極大縮短酶解反應(yīng)時間，但要對兩種酶的應(yīng)用條件合理調(diào)整，確定酶解溫度為55℃，pH控制在7.0，重點是研究酶的用量以及確定酶解反應(yīng)時間。

2 結(jié)果與討論

對試驗所用的豆渣進行成分分析，結(jié)果見表1，從豆渣成分表可以看出，其主要成分是纖維和蛋白質(zhì)，二者占總干物質(zhì)85%以上。

表1 豆渣成分Table 1 Ingredient of soybean dregs %

2.1 蛋白酶酶解豆渣研究

分別研究了Alcalase堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶不同加酶量及酶解時間對蛋白質(zhì)水解度的影響，圖1為Alcalase堿性蛋白酶的酶添加量與酶解時間對蛋白質(zhì)水解度的影響。

隨著反應(yīng)時間的延長，水解度不斷增加，反應(yīng)時間超過6 h后，增加速率變緩，繼續(xù)延長反應(yīng)時間不利于提高生產(chǎn)效率，因此在實際應(yīng)用中酶解反應(yīng)時間不應(yīng)超過6 h；雖然增加酶的使用量也使水解度增加，考慮到生產(chǎn)成本，酶的用量不應(yīng)無限增加。在能滿足工藝要求的前提下，盡可能選用低加酶量。

所用的風(fēng)味蛋白酶不同加酶量及酶解時間對蛋白質(zhì)水解度的影響如圖2所示。

風(fēng)味蛋白酶的酶解效果與堿性蛋白酶類似，酶量的增加和時間的延長都使豆渣中的蛋白質(zhì)水解度增加。

比較兩種蛋白酶的水解效果，在實驗條件下得到的水解液均無苦味。在相同的加酶量和相同的反應(yīng)時間，Alcalase堿性蛋白酶水解度高于風(fēng)味蛋白酶。以加酶量2000 U/g，反應(yīng)時間為4 h為例，Alcalase堿性蛋白酶水解度為6.6%，風(fēng)味蛋白酶水解度只有3.8%，故選用Alcalase堿性蛋白酶為試驗用酶。

2.2 纖維素酶酶解豆渣研究

重點研究不同加酶量及反應(yīng)時間對水解液中還原糖含量的影響，圖3給出了不同的加酶量在不同的反應(yīng)時間后溶液中還原糖的變化情況。

從圖3中可以看出，酶量的增加和時間的延長都會使溶液中還原糖的含量增加，但在實際應(yīng)用中，酶量的增加將加大生產(chǎn)成本，時間的延長會降低生產(chǎn)效率。得到的酶解液在能滿足后續(xù)發(fā)酵要求的前提下，反應(yīng)時間應(yīng)盡可能縮短，酶用量盡可能少。

采用性纖維素酶水解豆渣時，同時可以提高可溶性成分含量，豆渣可溶性纖維素酶解產(chǎn)物得率的計算方法：

式中：外加物質(zhì)是指加入的酶及調(diào)節(jié)pH時加入的酸或堿。

圖4顯示的是不同的加酶量在不同的反應(yīng)時間后，豆渣經(jīng)纖維素酶分解后可溶性產(chǎn)物的得率。

酶量的增加以及反應(yīng)時間的延長都會提高可溶性物質(zhì)的產(chǎn)率，但隨著反應(yīng)時間的延長，提高速率變緩，因此反應(yīng)時間不宜超過6 h。酶用量的成倍增加，并未使得纖維素酶的水解率也成倍增加，因此酶用量可減少些。

2.3 蛋白酶和纖維素酶協(xié)同酶解豆渣的研究

根據(jù)單一酶解的研究結(jié)果，尋求適合蛋白酶和纖維素酶兩種酶都能適應(yīng)的反應(yīng)條件。

確定反應(yīng)條件：豆渣和水（1∶4，質(zhì)量比）室溫下混合，調(diào)節(jié)pH 7.0，溫度55℃。

添加Alcalase堿性蛋白酶6000 U/g和纖維素酶1.5%，水解一定時間后，滅酶，8000 r/min離心10 min，得豆渣雙酶水解液。測定水解產(chǎn)物得率。

式中：外加物質(zhì)是指加入的酶及調(diào)節(jié)pH時加入的酸或堿。

圖5顯示的是酶解時間與水解產(chǎn)物得率的關(guān)系。

從圖5中可以看出隨著反應(yīng)時間的延續(xù)，豆渣水解的可溶性產(chǎn)物逐漸增多，但是反應(yīng)超過4 h后增加速率變緩，從實際應(yīng)用的角度出發(fā)，反應(yīng)時間不宜過長，越短越好，以反應(yīng)4 h為宜。

3 結(jié)論

將濕豆渣和水按1∶4（質(zhì)量比）的比例室溫下混合均勻，調(diào)節(jié)p H 7.0，在溫度達(dá)到55℃時，同時加入堿性蛋白酶6000 U/g和纖維素酶1.5%，控制溫度55℃，水解4 h滅酶終止反應(yīng)。此工藝簡單，由于蛋白酶和纖維素酶同時進行反應(yīng)縮短反應(yīng)時間，豆渣的水解度可達(dá)到9.03%。水解液中主要含有還原糖、氨基酸和肽類，達(dá)到預(yù)期目的，將此酶解液用作發(fā)酵原料將在后續(xù)的工作中繼續(xù)研究。

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Hydrolysis of Soybean Sregs by Proteases and Cellulase for Fermentation Medium

LI Lin,LI Hai-mei,HE Sheng-hua,MA Ying*
（School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,Heilongjiang,China）

2011-12-28

黑龍江省“十一五”科技攻關(guān)項目（GA09B401-7）

李琳（1962—），男（漢），副教授，研究生，研究方向：食品加工。

*通信作者