萬瑾瑾，孫萍，劉旭海

（1.南昌市第三醫(yī)院，江西南昌330006；2.江中藥業(yè)股份有限公司，江西南昌330096）

鮮麻山藥酚類物質(zhì)酶促褐變的研究

萬瑾瑾1，孫萍2，劉旭海2

（1.南昌市第三醫(yī)院，江西南昌330006；2.江中藥業(yè)股份有限公司，江西南昌330096）

對鮮麻山藥酚類物質(zhì)的分布，酚類物質(zhì)的種類進(jìn)行研究，從而確定一種酶促褐變的底物，對PPO酶的活性及其與褐變底物的親和力進(jìn)行分析和研究。表明鮮麻山藥是由于酚類物質(zhì)在PPO下進(jìn)行的酶促褐變。并篩選出抑制麻山藥PPO酶活力的最佳溫度、酸堿環(huán)境和抑制劑。

鮮麻山藥；酚類；PPO活力

Abstract:The relationship between the distribution of phenol and the type of phenol in fresh-cut yams was analyzed.Then the main browning substrate which led to enzymatic browning in fresh-cut yams was identified by thin-layer chromatography and absorption spectrum.The polyphenol oxidase enzame(PPO)activity and affinity with the main browning substrate was assayed.This result indicated that the browning in fresh-cut yams was mainly due to the oxidation of phenols.Screening the optimal temperature,optimal pH and optimal inhibitors that can inhibited the PPO activity.

Key words：fresh linen yam;phenol;PPO activity

山藥的種類繁多，目前文獻(xiàn)中報(bào)道的多是河南鐵棍山藥，但近年來鐵棍山藥的產(chǎn)量低，應(yīng)用少，大多數(shù)山藥飲片被“中國山藥之鄉(xiāng)”的“蠡縣麻山藥”取代?！绑豢h麻山藥”獨(dú)有的藥用價(jià)值正逐漸被大眾所接受，是具有地理標(biāo)志、獨(dú)具規(guī)模的保護(hù)產(chǎn)品。其營養(yǎng)價(jià)值非常高，含有豐富的黏液質(zhì)、淀粉、淀粉酶、氨基酸等成分，同時(shí)還含有一些維生素以及微量元素。

山藥的飲片制備需要去皮干燥，但山藥去皮后易發(fā)生褐變，影響藥材質(zhì)量。傳統(tǒng)的山藥護(hù)色加工工藝為硫磺熏制，殘留的二氧化硫和亞硫酸鹽對人類的健康存在潛在危害，因此研究新的護(hù)色方法，顯得尤為迫切。首先必需對鮮麻山藥的褐變機(jī)理展開研究，便于找尋較優(yōu)的抑制褐變方法。

山藥[1-3]和其他薯蕷[4]的主要氧化酶集中在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）上，能促進(jìn)酚類物質(zhì)的氧化，引起褐變。對山藥中酚類物質(zhì)種類的研究報(bào)道少，因此針對麻山藥中的酚類物質(zhì)及引起酶促褐變的PPO酶活力展開研究。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

鮮麻山藥：產(chǎn)自河北安國蠡縣大曲堤鄉(xiāng)種植地；染色液：0.5%FeCl3和 0.5%K3[Fe（CN）6]的 1∶1 混合液；鋼刀；NaOH；HCl；吐溫-60；甲萘酚；愈創(chuàng)木酚；鄰苯二酚；磷酸；磷酸氫二鈉；無水硫代硫酸鈉；植酸；EDTA-2Na；檸檬酸；氯化鈣；氯化鈉；抗壞血酸鈉；所有試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

超聲波清洗儀SK5200H：200 W，59 kHz上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)；TL-5.0W臺(tái)式離心機(jī)：上海離心機(jī)械研究所；METTLER AE240電子天平：梅特勒托利多儀器有限公司；奧林巴斯數(shù)碼相機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鮮切麻山藥的染色與自然褐變

參照王佳宏等[5]的方法略有改進(jìn)。取鮮麻山藥，洗凈，一部分鋼刀去皮，橫切成片，未去皮部分直接橫切成片。分別將所準(zhǔn)備鮮麻山藥泡于染色液中，取出后，對比被染成藍(lán)色的區(qū)域與鮮切麻山藥片未染色的常規(guī)褐變區(qū)域。

1.2.2 酚類物質(zhì)供試品溶液的制備

取鮮麻山藥20 g，去皮，加95%乙醇少許，冰浴碾磨成勻漿后離心（4000 r/min，4℃，15 min），上清液減壓濃縮至干，殘?jiān)?5 mL乙酸乙酯抽提3次，合并抽提液，保存于冰箱中，即為供試品溶液。

1.2.3 酚類物質(zhì)對照品溶液的制備

分別配置甲萘酚、愈創(chuàng)木酚和鄰苯二酚的0.6mL/min對照品溶液。

1.2.4 薄層層析的方法

吸取供試品溶液以及甲萘酚、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各約10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿∶甲醇=5∶1為展開劑，展開，取出，晾干，用染色液顯色。

1.2.5 PPO酶液的提取方法

參照周玉嬋[6]和仲飛[7]的方法，略有改進(jìn)。取待測麻山藥塊莖，清洗去皮，取10 g樣品，加少許預(yù)先冷藏的磷酸緩沖液（PBS：pH6.0），冰浴研磨，然后加 10 mL緩沖液冷凍離心（4000 r/min，15 min，4℃），上清液即為PPO酶液。制成的酶液置于低溫（4℃）下備用。

1.2.6 PPO活力的測定[7]方法

采用消光值法。吸取磷酸緩沖液（pH6.0）1.5 mL，加入1mL0.02mol/L的兒茶酚溶液，先于30℃保溫5min，再加1 mL的酶液，迅速混勻后立即在410 nm處進(jìn)行紫外測定并紀(jì)錄A410的變化（每隔30秒記錄1次吸光值），共記錄5 min，重復(fù)測3次。一個(gè)活力單位（U）定義為測定條件下每0.5分鐘引起吸光值改變0.01的酶量，設(shè)為OD值。

1.2.7 褐變指數(shù)的測定方法

采用消光值法[8]。取處理后的麻山藥粉2 g，置于潔凈的碘量瓶中，加入純水及甲醇的混合液（1∶1）20 mL，在50℃水浴鍋中加熱30min，離心（4000r/min，15min），取上清液，在波長410 nm處測定吸收值，作為褐變指數(shù)。

1.2.8 相關(guān)計(jì)算公式

以每分鐘吸光值變化0.01為一個(gè)活力單位（U），設(shè)為OD值，計(jì)算所有樣品的酶活力單位數(shù)。OD=△A/（0.01×t）×D（D 為稀釋倍數(shù)）。

1.2.9 溫度對PPO活力的影響

將酶液反應(yīng)體系分別置于 15、30、45、60、75 ℃的緩沖液（pH 6.0）中測定PPO活力，得到麻山藥PPO酶的最佳反應(yīng)溫度。

1.2.10 pH對PPO活力的影響

將酶液反應(yīng)體系用磷酸緩沖液調(diào)至不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10），測定 PPO 活力，得到麻山藥 PPO 酶的最佳鈍化pH。

1.2.11 底物濃度對PPO活性的影響

分別以 0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mol/L的鄰苯二酚作底物，測定不同底物濃度下麻山藥PPO的活性大?。╬H 6.0、30℃）。根據(jù)Linewear-Burk方程1/V=Km/Vmax{1/[s]}+1/Vmax求得此條件下的Km及Vmax值。

1.2.12 無硫護(hù)色抑制劑對PPO活力的影響

分別以濃度為0.15%抗壞血酸鈉、0.25%檸檬酸、0.25%CaCl2、0.25%Na2SO3、0.02%EDTA-2Na、1%NaCl、0.1%植酸等多種化合物與等體積的酶液混合，室溫下靜止30 min，在pH 6.0條件下測定PPO活力，比較不同化合物對PPO的抑制作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 鮮麻山藥褐變與酚類物質(zhì)的關(guān)系

被染成藍(lán)色的區(qū)域?yàn)榉宇愇镔|(zhì)的分布區(qū)域，見圖1，與鮮切麻山藥片未染色的常規(guī)褐變圖2對比。

圖1顯示，酚類物質(zhì)多分布在周皮及維管束脈管切口部位，并與鮮麻山藥常規(guī)放置發(fā)生褐變（圖2）的部位非常一致。圖2中，周皮部位褐變程度有差異，這與去皮的厚薄有關(guān)，說明切除的皮越厚，周皮部位殘留的酚類物質(zhì)越少，褐變程度越小。

2.2 鮮麻山藥中酚類物質(zhì)的薄層定性

試驗(yàn)結(jié)果顯示，供試品在與對照品色譜的相應(yīng)位置上，有兩個(gè)相同顏色斑點(diǎn)，且有許多其他酚類的顯色斑點(diǎn)，見圖3。

麻山藥酚類提取物與Rf值分別為0.697和0.462的愈創(chuàng)木酚和鄰苯二酚相應(yīng)位置上，有相同的顯色反應(yīng)，故麻山藥酚類提取物中含有愈創(chuàng)木酚和鄰苯二酚。且麻山藥所含酚類物質(zhì)種類還有很多，如果要抑制褐變的產(chǎn)生，從酚類物質(zhì)著手較困難。

2.3 溫度對PPO活力的影響

溫度對PPO活力的影響見圖4。

圖4表明，麻山藥PPO酶的最活躍溫度在15℃~45℃之間，溫度在30℃酶活力最大。當(dāng)溫度升至45℃以上時(shí)，PPO活力相對較低；60℃以上時(shí)活力低且相對穩(wěn)定，綜合資源的合理利用，可選擇60℃作為麻山藥最適宜減少褐變的溫度。這與黃紹華等[3]、李曉莉等[9]、邱雁臨等[1]所做的山藥PPO特性研究中所得的結(jié)果相近。

2.4 pH對PPO活力的影響

pH對PPO活力的影響圖5。

由圖5可知，PPO酶在堿性環(huán)境及在酸性環(huán)境pH為3和6的PPO酶活力較大，是PPO酶的最適宜酸堿度。由于酚類物質(zhì)顯弱酸性，在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，故推測在堿性緩沖液中的PPO酶活力測定有誤差，將pH為3和6定為PPO酶的最適反應(yīng)酸堿度。

經(jīng)感官鑒定，pH為3條件下的山藥片色白，但按1.2.7方法處理后的溶液較渾濁，故測得的褐變指數(shù)值較高，其他感官結(jié)論與褐變值一致。因此當(dāng)pH=6時(shí)，是PPO酶最適反應(yīng)酸堿度；pH=4和5時(shí)，為最佳抑制酶活力酸堿度。

2.5 底物濃度對PPO活力的影響

底物濃度對PPO活力的影響見圖6。

由圖6可知，當(dāng)?shù)孜?鄰苯二酚)濃度較低時(shí)，反應(yīng)速度與底物近似呈線性關(guān)系；隨著底物濃度增加，反應(yīng)速度增加變緩；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?.06 mol/L時(shí)，酶活性不再上升，而出現(xiàn)下降趨勢。由此可見，當(dāng)?shù)孜餄舛融呌贙m時(shí)，反應(yīng)速度趨向最大值（Vmax），即麻山藥PPO活性的最適反應(yīng)底物濃度是0.06 mol/L。底物濃度與PPO活性的關(guān)系完全遵循Michaelis-Menten的酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。

根據(jù)Lineweaver-Burk方程1/V=Km/Vmax{1/[s]}+1/Vmax，以1/V為縱坐標(biāo)，1/[s]為橫坐標(biāo)作圖7，求得Km=61 mmol/L，Vmax=25.6 U/min，其中擬合直線為Y=2.3808X+39.045，相關(guān)系數(shù)r=0.9995，表明麻山藥PPO對鄰苯二酚有極強(qiáng)的親和力。在一定的溫度、pH和酶液濃度條件下，酶催化反應(yīng)速度的初始階段與鄰苯二酚底物濃度成正比。

2.6 抑制劑對PPO活力的影響

0.15 %抗壞血酸鈉、0.25%檸檬酸、0.25%CaCl2、0.25%Na2SO3、0.02%EDTA-2Na、1%NaCl、0.1%植酸對鮮切山藥PPO活力的影響見表1。

不同化合物對PPO抑制程度的差異結(jié)果顯示抗壞血酸鈉和Na2SO3有很強(qiáng)的抑制作用，EDTA-2Na和CaCl2也有一定的抑制作用，檸檬酸、NaCl和植酸的抑制作用較弱。

表1 抑制劑對PPO活力的影響Table 1 PPO activity's influence by inhibitors

抗壞血酸鈉的褐變抑制率雖然高，但它本身被氧化后會(huì)變紅色，同樣影響山藥的外觀和質(zhì)量。Na2SO3是最佳PPO酶抑制劑。

3 結(jié)論

1）麻山藥酚類物質(zhì)多分布在周皮及維管束脈管切口部位，與褐變部位相一致，因此麻山藥的褐變與其酚類物質(zhì)有關(guān)。

2）鮮麻山藥易褐變，影響山藥藥材質(zhì)量，山藥的褐變正是愈創(chuàng)木酚和鄰苯二酚等酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的作用下氧化導(dǎo)致，酚類種類多且含量較高，抑制褐變的發(fā)生應(yīng)從種類相對單一的PPO酶出發(fā)。研究結(jié)果顯示，鮮麻山藥PPO酶對底物鄰苯二酚的Km=61 mmol/L，Vmax=25.6 U/min，抑制PPO酶活力的最佳條件是溫度在60℃，pH在4和5之間，用含0.25%Na2SO3的PPO酶抑制劑處理。

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[6]周玉嬋,潘小平.采后低溫誘導(dǎo)菠蘿PPO活性升高的機(jī)理及其抑制途徑[J].園藝學(xué)報(bào),1997,24(3):236-238

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The Research of Phenols Browning in Fresh Yams by Enzymatic Browning

WAN Jin-jin1,SUN Ping2,LIU Xu-hai2
(1.The Third Hospital,Nanchang 330006,Jiangxi,China;2.Jiangzhong Pharmaceutical Co.,Ltd.,Nanchang 330096,Jiangxi,China)

2011-11-27

萬瑾瑾（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：新制劑與新工藝。