郭偉堅 簡優(yōu)強 張國超 鄧春艷 齊 暉 李富榮 周漢新

(暨南大學第二臨床醫(yī)學院深圳市人民醫(yī)院臨床研究中心，深圳518020)

抗CD45RB抗體是一種新型的免疫耐受誘導劑，可以通過上調CD45RBloT細胞和下調CD45RBhiT細胞的比例來延長移植物的存活時間，抑制排斥反應的發(fā)生［1］。在小鼠腎、胰島和心臟移植應用抗體治療都可以成功地延長移植物的存活時間并誘導產生穩(wěn)定的免疫耐受［2-4］。在免疫耐受誘導過程中，調節(jié)性T細胞(regulator T cell，Treg)與Th17細胞是一組作用相反的T細胞亞群，其中Treg細胞可以促進免疫耐受的形成，而Th17細胞則會阻礙耐受的產生［5］。本課題組已證實了抗CD45RB抗體可以通過上調調節(jié)性CD4+CD25+CD127-T細胞百分率和增加Foxp3mRNA表達量來誘導小鼠心臟移植免疫耐受［6］，然而該抗體對Th17細胞的分化有何影響尚未清楚。在免疫耐受形成過程中，IL-2參與誘導初始CD4+CD25-T細胞轉化為CD4+CD25+T細胞并表達Foxp3，使其具備調節(jié)性 T細胞的特性［7］。此外，IL-2是Th17細胞分化的抑制因素，它通過STAT5信號傳導對Th17細胞的分化起到抑制作用［8］。本研究通過體外及體內實驗探討IL-2在抗CD45RB抗體誘導的免疫耐受中對Treg/Th17細胞的分化有何影響，并進一步闡明抗CD45RB抗體誘導免疫耐受的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性8周齡C57BL/6和BALB/c小鼠，體重20～25克，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號:SCXK(粵)2006-0015)，飼養(yǎng)在SPF級動物實驗室(暨南大學第二臨床醫(yī)學院實驗動物中心)，所有動物實驗經過當地倫理委員會批準，對動物處置方法符合動物倫理學要求。

1.1.2 試劑及器材 抗小鼠CD45RB抗體(美國BioXcell);小鼠IL-2(美國Peprotech公司);淋巴細胞分離液(達科為生物技術有限公司);抗小鼠CD4-PEcy5、IL-17A-FITC、Foxp3-PE 及相應同型對照(eBioscience);佛波酯(Phorbol 12-Myristate 13 Acatate，PMA)、離子霉素及布雷菲德菌素A(Brefeldin-A，BFA)(美國Sigma公司);流式細胞儀(EPICS ALTRA，美國貝克曼庫爾特公司);小鼠CD4+T細胞陰性分選磁珠(德國美天旎)。

1.2 方法

1.2.1 初始CD4+T細胞的分選及鑒定 處死8周齡雄性C57BL/6小鼠，無菌取脾制成單細胞懸液，利用小鼠淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。用免疫磁珠陰性分選其中的CD4+T細胞，每1×107個細胞用40 μl緩沖液(pH=7.2)重懸，每1×107個細胞先加入 10 μl Biotin-Antibody Cocktail混勻，4℃孵育10分鐘;然后加入 20 μl Anti-Biotin MicroBeads混勻，4℃孵育15分鐘，洗滌后用500 μl緩沖液重懸，并用分選柱通過磁珠分離器分選CD4+T細胞，分選出的CD4+T細胞經細胞免疫熒光染色，流式細胞儀檢測細胞純度＞90%。

1.2.2 IL-2和抗CD45RB抗體與CD4+T細胞共培養(yǎng)對Treg/Th17分化的影響向24孔板中每孔加入CD4+T細胞 1×106個，將實驗分為4個組:①CD4+T;②CD4+T+抗CD45RB抗體;③CD4+T+IL-2;④CD4+T+抗 CD45RB抗體 +IL-2，然后用10%FBS RPMI1640每孔定容至1 ml，其中加入抗CD45RB 抗體 為20 μg/ml、IL-2 為100 U/ml。37℃5%CO2培養(yǎng)72小時。每組設3個復孔。培養(yǎng)72小時后取細胞作流式免疫熒光染色，流式細胞儀檢測Treg/Th17細胞百分率。

1.2.3 IL-2和抗CD45RB抗體對小鼠皮膚移植生存期的影響 取8周齡雄性BALB/c小鼠為供體，8周齡雄性C57BL/6小鼠為受體，進行同種異基因小鼠皮膚移植。在供體鼠胸背部取1×1 cm的皮膚，去筋膜后移植至受體鼠胸背部，用5-0尼龍絲線縫合10～12針，術后用紅霉素眼膏+創(chuàng)口貼包扎，第7天打開包扎觀察皮膚存活情況。術后根據不同治療方案分為3個組，每組20只移植鼠。對照組:腹腔注射生理鹽水100 μl;抗CD45RB抗體組:在術后0、2、4、6、8 天給予腹腔注射抗 CD45RB 抗體100 μg/天;抗CD45RB抗體+IL-2組:在抗體CD45RB抗體治療同時，在術后0、1、2天給予腹腔注射IL-2 2 μg/天。術后小鼠蘇醒后單籠飼養(yǎng)，每日觀察活動情況及皮膚移植物的存活狀況，記錄皮膚排斥壞死時間。

1.2.4 Th17/Treg細胞檢測 取上述共培養(yǎng)后72小時后的各組CD4+T細胞重懸;皮膚移植在術后第1、3、5、7、9 天，每組各處死 3 只小鼠取脾臟，制成脾細胞懸液。調整細胞濃度為1×106個/ml，取100 μl細胞懸液分別加入 50 ng/ml PMA、1 μg/ml離子霉素、10 μg/ml BFA37℃ 刺激 6 小時。加入 1.5 μl CD4-PEcy5抗體，避光孵育15分鐘后，加入破膜/固定工作液對細胞固定和破膜，再加入抗IL-17A-FITC抗體和抗Foxp3-PE抗體各1.5 μl，染色30分鐘后清洗，流式細胞儀分析Treg和Th17細胞百分率。

1.3 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計處理采用SPSS13.0軟件，各組皮膚移植小鼠的皮膚移植物存活率及生存曲線用log-rank檢驗。所有數據用x±s表示，兩組均數間的比較采用獨立樣本的t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL-2對抗CD45RB抗體誘導Treg/Th17細胞分化的影響 收集培養(yǎng)72小時后各組CD4+T細胞三色法染色后流式細胞儀檢測各組中CD4+FoxP3+Treg和 CD4+IL-17+Th17細胞的陽性率?？笴D45RB抗體作用于CD4+T細胞后可以促進其向Treg細胞分化(11.53±0.57)%，抑制其向Th17細胞分化(3.13±0.32)%(圖1，P ＜0.05);在 IL-2共同作用下，增強向 Treg細胞分化作用(14.20±0.50)%，并抑制向Th17細胞分化作用(2.23±0.15)%(圖1，P ＜0.05)。

2.2 受體鼠皮膚移植存活期的觀察 移植術后小鼠在不給予抗體治療的對照組小鼠皮膚移植物只能存活10天左右;使用抗CD45RB抗體治療可以延長存活期至20天;抗CD45RB抗體與IL-2聯合治療，可顯著延長存活期至25天(圖2)。

2.3 受體鼠移植皮膚的病理學變化 在移植后第9天，取各組皮膚移植物作病理切片，觀察移植皮膚的炎性細胞浸潤情況，正常小鼠皮膚無炎性細胞浸潤(圖3A);對照組移植皮膚具有嚴重的細胞，炎癥細胞浸潤皮膚全層(圖3B);抗CD45RB抗體組有輕度的炎性細胞浸潤(圖3C);抗CD45RB抗體+IL-2組只有少量炎性細胞浸潤(圖3D)。各治療組小鼠移植皮膚雖然有炎癥細胞浸潤，但僅限于筋膜層，真皮層浸潤并不嚴重。

2.4 受體鼠體內Treg和Th17細胞的動態(tài)變化對皮膚移植小鼠，在術后第1、3、5、7、9天取脾細胞，觀察Treg細胞和Th17細胞的動態(tài)變化。對Treg細胞觀察，在對照組中沒有明顯變化，抗CD45RB抗體組隨時間明顯上升，抗CD45RB抗體+IL-2組上升最快最明顯，較對照組和抗CD45RB抗體組明顯升高(圖4)。在Th17細胞觀察中，對照組升高最快最明顯，抗CD45RB抗體組呈中度升高，抗CD45RB抗體+IL-2組只有輕度升高(圖5)。

圖1 體外各組CD4+T細胞培養(yǎng)72小時后Treg/Th17細胞所占的比例Fig．1 The percentage of Treg/Th17 cells in cultured CD4+T cells detected by FCM in vitro

圖2 移植皮膚生存曲線Fig．2 Survival curves of skin graft

圖3 各組皮膚移植小鼠術后第9天移植皮膚的病理切片Fig．3 Histology of BALB/c mouse skin allografts on day 9 after transplantation

圖4 體內Treg細胞動態(tài)變化Fig．4 Dynamic changes of Treg cells in vivo

圖5 體內Treg細胞動態(tài)變化Fig．5 Dynamic changes of Th17 cells in vivo

3 討論

大量的動物實驗證明，抗CD45RB抗體可以成功誘導免疫耐受并能逆轉排斥反應?？笴D45RB抗體誘導免疫耐受可通過多種途徑發(fā)揮作用，它可以通過上調CTLA-4分子向T細胞釋放負向調節(jié)信號［9-11］;在誘導免疫耐受過程中需要完整的胸腺，并通過胸腺產生供體特異性Treg細胞誘導免疫耐受，在缺失胸腺的情況下雖然在外周免疫系統(tǒng)中依然有免疫抑制的活性，但并不能夠誘導免疫耐受的形成［12］;在誘導免疫耐受時需要宿主B淋巴細胞的參與，并且通過B細胞與T細胞的相互作用誘導免疫耐受［13］;通過有效抑制成熟樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)的功能和產生耐受型DCs誘導免疫耐受的形成［14］。此外，抗體還可以清除引起免疫排斥反應的CD45RBhiT細胞，使CD45RBloT細胞富集，從而調節(jié)CD45RBloT細胞與CD45RBhiT細胞的比例，抑制排斥反應的發(fā)生，延長移植物的存活時間甚至誘導產生穩(wěn)定的特異性免疫耐受［15］。

在免疫耐受形成過程中，Treg細胞發(fā)揮著舉足輕重的作用，多種誘導免疫耐受方案是通過各種免疫耐受誘導劑促使T細胞向FoxP3+Treg細胞分化從而產生穩(wěn)定的免疫耐受［16］。外周免疫系統(tǒng)中的初始CD4+T細胞在TGF-β和IL-2的共同作用下可以向Treg分化，并通過分泌TGF-β和IL-10發(fā)揮著免疫調節(jié)的作用來誘導免疫耐受［17］。近年來研究發(fā)現，免疫系統(tǒng)中存在著一種功能與Treg細胞相反的Th細胞亞群，這種Th細胞以分泌IL-17為特征，稱為Th17細胞，參與自身免疫性疾病及免疫排斥反應的發(fā)生?；罨蟮某跏糃D4+T細胞在TGF-β和IL-6的共同作用下可以向Th17分化，并通過分泌IL-17來介導炎性反應，抑制免疫耐受的產生［5］。Treg與Th17細胞作為一組作用相反的T細胞亞群，它們共同由初始CD4+T細胞分化而來，Treg/Th17細胞在體內誰占上峰發(fā)揮主導作用，決定免疫耐受或免疫排斥反應的發(fā)生程度［5］。在本研究中，抗CD45RB抗體與CD4+T細胞共培養(yǎng)，抗CD45RB抗體具有促進CD4+T細胞向Treg細胞分化，抑制向Th17細胞分化作用。在同種異體皮膚移植模型中，抗CD45RB抗體的治療，使移植物存活期明顯延長，同時Treg細胞數量較對照組逐漸明顯升高，Th17細胞數量呈下降。上調Treg細胞和抑制Th17細胞數量可能是抗CD45RB抗體誘導免疫耐受的主要機制之一。

IL-2是一種T細胞生長因子，主要由活化狀態(tài)下的效應T細胞分泌，在Treg的分化、發(fā)育過程中發(fā)揮著很重要的作用，它通過與IL-2R結合進行信號傳導，從而增加未成熟Treg表達Foxp3和CD25，并促進其向成熟 Treg分化［18］。此外，IL-2還可以通過STAT5信號傳導途徑，下調多種Th17細胞分化相關基因的表達，抑制Th17細胞分化。在我們的實驗中發(fā)現，IL-2與抗CD45RB抗體共同作用下，可增強抗CD45RB抗體促進CD4+T細胞向Treg細胞分化作用，也增強抗CD45RB抗體抑制其向Th17細胞分化作用。在同種異體皮膚移植小鼠中，用IL-2聯合抗CD45RB抗體治療，較抗CD45RB抗體單獨治療，生存期明顯延長，移植皮膚中炎癥細胞的浸潤明顯減少。我們的前期研究發(fā)現，抗CD45RB抗體并不能直接作用于Treg細胞使其擴增，但它可以使低表達CD45RB分子的Treg細胞富集。由于IL-2具有促進Treg細胞分化并抑制Th17細胞分化的作用，與抗 CD45RB抗體聯合應用后可增強抗CD45RB抗體對Treg/Th17細胞的調節(jié)作用，提示IL-2具有協同抗CD45RB抗體的作用，延緩排斥反應的發(fā)生，延長移植皮膚的存活時間。

綜上所述，抗CD45RB抗體在誘導免疫耐受中，具有上調Treg細胞和抑制Th17細胞的作用，IL-2可以增強抗CD45RB抗體的作用，延緩小鼠同種異基因皮膚移植排斥反應的發(fā)生，延長移植物的存活時間。因此，在抗CD45RB抗體誘導免疫耐受時聯合應用IL-2治療可以更有效地誘導免疫耐受，為免疫耐受的誘導提供新的治療策略。

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