李 立 陳建發(fā)(廣東醫(yī)學院廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 湛江 524023)

有關肺癌發(fā)生發(fā)展分子機制的研究雖然已取得顯著進展，但肺癌的治療效果仍不令人滿意〔1〕。如非小細胞肺癌(NSCLC)，其對放療的反應率低下，5年生存率僅 7% ～10%〔1〕。有兩個原因限制了NSCLC放療效果:腫瘤的放療抗性及放療對正常組織的毒性。NSCLC產(chǎn)生放療抗性的機制仍不明了，雖然一些研究顯示可能與p53突變、survivin過表達有關〔2〕。目前，在肺癌的治療中還未出現(xiàn)與放療并用的分子靶向治療，因此，有必要鑒定與放療抗性有關的基因，以便尋找新藥并提高放療敏感性。本研究采用siRNA技術，體外沉默NSCLC細胞內(nèi)細胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族成員Apollon的基因表達，檢測NSCLC細胞對放療敏感性的變化，并探討Apollon作為癌癥治療靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) NSCLC細胞株為轉(zhuǎn)染野生型及突變型p53基因的H1299/wtp53及H1299/mp53，由日本東北大學加齡醫(yī)學研究所醫(yī)用細胞資源中心提供，于含10%新生牛血清(FBS，HyClone)的RMPI 1640培養(yǎng)液(Sigma)內(nèi)，在37℃、含5%CO2的飽和濕度空氣中培養(yǎng)。

1.2 siRNA轉(zhuǎn)染 播種H1299/wtp53或H1299/mp53細胞5×105個于直徑10 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)液調(diào)至8 ml，培養(yǎng)24 h。712 μl的 Opti-MEMImedium (GIBCO)與 8 μl 100 μmol/L的 Apollon siRNA(正義鏈 5'-CAG ACC AGU GCA AGA UCA G-3'，反義鏈 5'-CUG AUC UUG CAC UGG UCU G-3';Thermo)混勻，設為 A液;64 μl的 Opti-MEMI medium 與16 μl的 Oligofectamine(Invitrogen)混勻，設為 B 液;A、B 液混勻，室溫孵育15～20 min。棄除培養(yǎng)液，將3.2 ml的Opti-MEMI medium及A、B液的混合液加入培養(yǎng)皿，Apollon siRNA的最終濃度則為200 nmol/L。4 h培養(yǎng)后，添加1 ml的新生牛血清于培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h，取部分細胞抽提RNA用于RT-PCR分析，剩余細胞則用于后續(xù)實驗。對照siRNA(Thermo)轉(zhuǎn)染方法同上。

1.3 RNA提取及RT-PCR 總RNA提取采用TRIZOL(Invitrogen)試劑，并按試劑所付操作指南操作。每1×106～3×106個細胞加TRIZOL 1 ml，裂解細胞、室溫孵化;以每1 ml TRIZOL加0.2 ml的比例添加CIAA(Chloroform:Isoamyl alcohol=24∶1)(Wako)，混勻、室溫孵化;離心，將水層部分移入新的微離心管內(nèi)，以1 ml TRIZOL加0.5 ml IP(2-Propanol)(Wako)的比例添加 IP(Isopropyl alcohol，Wako)，混勻、室溫孵化;離心，除去上清;以1 ml TRIZOL加1 ml 75% 乙醇的比例添加75%乙醇，離心，除去上清、干燥;加適當diethylpyrocarbonate(DEPC)水溶解。取總RNA 500 ng，用于cDNA的合成。DnaseⅠ處理后，應用逆轉(zhuǎn)錄試劑(Invitrogen)在20 μl的反應體系中，按試劑所附操作指南進行逆轉(zhuǎn)錄反應。反應后，添加30 μl蒸餾水，使被合成的cDNA總體積為50 μl，用于確定Apollon基因表達的RT-PCR分析。

取蒸餾水將7.5 μl的2×Quantitect SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN)、各1 μl的 Apollon正反引物(正義鏈5'-CGT TGT GAT TAA TGC CGA ACT TG-3'及反義鏈5'-GGT CTA GCC CTT GCA ATT TCT CA-3')(10 μmol/L)及 1 μl cDNA調(diào)整到15 μl，采用 iCycler(Bio-Rad)進行 PCR 反應，并以β-actin引物(正義鏈5'-GCC AAC CGC GAG AAG ATG A-3'及反義鏈:5'-CAT CAC GAT GCC AGT GGT-3')為內(nèi)參。

1.4 克隆生成分析 采用X線發(fā)生裝置(Model MBR-1520R，Hitachi)，分別以 0、1、2、4、6、8 Gy 的劑量照射上述經(jīng)轉(zhuǎn)染 siRNA的NSCLC細胞。照射后，將細胞以200個/孔的比例播種于12孔細胞培養(yǎng)板，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)后，檢測細胞克隆數(shù)，每個克隆細胞數(shù)需超過20個以上，計算克隆生成率(Surviving fraction)并繪制曲線。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Apollon siRNA抑制Apollon基因表達 無論是在H1299/wtp53細胞內(nèi)，還是在H1299/mp53內(nèi)，與對照siRNA相比較(0.053，0.071)，Apollon基因表達均有下降，提示 Apollon siRNA可靶向沉默Apollon基因表達。

2.2 沉默Apollon基因?qū)毎寺⌒纬傻挠绊?Apollon siRNA處理并經(jīng)7 d培養(yǎng)后，在未經(jīng)X線照射的情況下，無論H1299/wtp53還是 H1299/mp53，細胞克隆生成率〔(61.2±3.8)%vs(100±4.6)%，P=0.000和(60.1±4.7)%vs(100±5.3)%，P=0.001〕均顯著降低。

2.3 p53狀態(tài)對NSCLC細胞放療效果的影響 在未經(jīng)Apollon siRNA處理的情況下(僅以對照siRNA處理)，雖然H1299/wtp53及H1299/mp53在1、2、4、6 Gy處的細胞克隆生成率沒有顯著差異，但在8 Gy處，H1299/wtp53較H1299/mp53細胞克隆生成率顯著下降(表1)。

表1 p53狀態(tài)對肺癌細胞克隆生成率的影響(，%)

表1 p53狀態(tài)對肺癌細胞克隆生成率的影響(，%)

0 Gy 1 Gy 2 Gy 4 Gy 6 Gy 8 Gy H1299/wtp53 3 100±4.6 90.5±5.8 75.1±2.9 40.9組別 n±4.5 15±5.8 1.4±0.7 H1299/mp53 3 100±5.3 92±5.8 79.2±5.6 37.9±2.1 15.7±4.2 5.1±1.4 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 0.017

2.4 沉默Apollon基因?qū)Ψ暖熋舾行缘挠绊?在任何X線劑量處，沉默Apollon基因均可降低NSCLC細胞克隆生成率，并且 H1299/wtp53及 H1299/mp53分別在1、2、4 Gy處及2、4 Gy處細胞克隆生成率下降幅度具有顯著性(表2)。

表2 Apollon siRNA對肺癌細胞H1299/wtp53、H1299/mp53克隆生成率的影響(，%)

表2 Apollon siRNA對肺癌細胞H1299/wtp53、H1299/mp53克隆生成率的影響(，%)

組別 n 0 Gy 1 Gy 2 Gy 4 Gy 6 Gy 8 Gy H1299/wtp53 control siRNA 3 100±4.6 90.5±5.8 75.1±2.9 40.9±4.5 15±5.8 1.4±0.7 Apollon siRNA 3 100±6.2 71.7±4.7 50.9±13.1 27.5±4.6 5.7±1.1 1.1±1.1 P值 ＞0.05 0.012 0.035 0.023 ＞0.05 ＞0.05 H1299/mp53 control siRNA 3 100±5.3 92±5.8 79.2±5.6 37.9±2.2 15.7±4.2 5.1±1.5 Apollon siRNA 3 100±7.8 83.9±7.5 55.9±11.5 27.5±4.3 10.9±2.2 1.4±2.5 P值 ＞0.05 ＞0.05 0.034 0.021 ＞0.05 ＞0.05

3 討論

Apollon ，又稱Bruce或BIRC6，是IAP家族最大成員，在氨基端含有一個桿狀病毒IAP重復結(jié)構域，在羧基端則含有一個泛素結(jié)合酶結(jié)構域。雖然Apollon抗細胞凋亡的生理功能還未明了，但已有信息表明Apollon通過泛素化降解促細胞凋亡蛋白Smac/DIABLO及抑制caspase活性以實施其細胞保護功能〔3〕。有報道稱Apollon在一些耐DNA損傷劑的腦腫瘤細胞內(nèi)表達上調(diào)，并且其過表達與兒童急性髓細胞白血病不良預后關系密切〔4〕。通過反義寡核苷酸或siRNA介導的Apollon下調(diào)可使腫瘤細胞更易于發(fā)生由抗癌藥物所誘導的細胞凋亡〔3，5，6〕，因此，沉默Apollon基因表達可能有利于癌癥治療。

不同的p53狀態(tài)可通過細胞凋亡誘導能力的不同影響癌細胞放療效率〔7〕，一些采用突變型p53轉(zhuǎn)染癌細胞株的研究表明，突變型p53蛋白組成性表達可導致放療抵抗〔8〕，臨床研究也顯示攜帶野生型p53的宮頸癌患者放療后有更佳的預后〔9〕，提示癌癥放療效果似乎基于p53基因狀態(tài)。在本研究中，雖然在1、2、4、6 Gy處，在未經(jīng) Apollon siRNA 處理的情況下，H1299/wtp53、H1299/mp53細胞對放療的反應沒有顯著差異，但在8 Gy處，H1299/wtp53克隆生成能力較H1299/mp53顯著降低，表明p53在某種程度上參與了X線殺滅肺癌細胞的過程。

在本研究中，Apollon siRNA可抑制Apollon基因表達，并導致H1299/wtp53、H1299/mp53細胞增殖活性下降、克隆生成能力減弱，從另一角度顯示出Apollon對細胞的保護功能。有研究表明，Apollon失活可通過p53依賴途徑或非p53依賴途徑誘導細胞凋亡發(fā)生〔6，10〕，提示Apollon siRNA處理可提高肺癌細胞對放療的敏感度。

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