孫永新，范愈燕，支楠，西山成，劉雅，黃雯，姚麗

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，沈陽 110001；2.香川大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理科，香川 671-0793，日本；3.首都醫(yī)科大學(xué)北京同仁醫(yī)院傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)科，北京 100730；4.首都醫(yī)科大學(xué)北京同仁醫(yī)院腎臟內(nèi)科，北京 100730；5.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎臟內(nèi)科，沈陽110001）

近來眾多的研究表明，腎素—血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用。大規(guī)模的臨床試驗(yàn)［1～3］證明，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑在臨床上的療效遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了其對(duì)控制血壓和改善血流動(dòng)力學(xué)的影響，說明RAS是導(dǎo)致糖尿病腎病微量蛋白尿的重要原因之一。我們先前的研究也證明，糖尿病OLETF大鼠在糖尿病發(fā)生早期腎內(nèi)血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）已經(jīng)異常升高［4，5］。然而，對(duì)早期糖尿病肥胖動(dòng)物模型中腎內(nèi)RAS異常激活的具體年齡階段目前尚無報(bào)道。本研究中，我們?yōu)榱嗣鞔_腎內(nèi)的RAS系統(tǒng)被異常激活的情況，觀察在糖尿病OLETF大鼠出生后第一天、哺乳期、斷奶后到成熟階段，腎臟發(fā)育過程中腎內(nèi)AngⅡ含量及RAS系統(tǒng)組成成分基因表達(dá)水平的改變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物：雌性妊娠晚期糖尿病OLETF大鼠和正常LETO大鼠均由日本大冢制藥公司提供（日本德島）。在雌性妊娠大鼠正常分娩后，取出生后第1、5和 14天及第 4、7、11、18和 30周的正常生長(zhǎng)的雄性糖尿病OLETF大鼠和正常LETO大鼠斷頭取材，每組8～12只。

1.1.2 儀器：無創(chuàng)血壓檢測(cè)儀（BP-98A，日本Softron有限公司）；大鼠血糖檢測(cè)儀（日本W(wǎng)ako工業(yè)株式會(huì)社）；DNA擴(kuò)增儀（OSO-406型，德國Biometra公司）。

1.1.3 試劑：尿中白蛋白檢測(cè)試劑盒（日本Shibayagi公司）；肌酐測(cè)定試劑盒（日本W(wǎng)ako工業(yè)株式會(huì)社）；PT-PCR的SYBR GreenⅠ和TaqMan探針檢測(cè)試劑盒（美國Applied Biosystems公司）；RNase-Free（美國Invitrogen公司）。

1.2 檢測(cè)項(xiàng)目

1.2.1 平均血壓測(cè)定和標(biāo)本收集：在大鼠清醒狀態(tài)下通過無創(chuàng)血壓儀檢測(cè)平均血壓，取每只大鼠反復(fù)測(cè)定6次的平均值［6］；在大鼠生長(zhǎng)過程中，從第6周開始每隔2周收集24 h的尿樣。大鼠斷頭后，左側(cè)腎臟的三分之一固定在10%的甲醛液體中保存，剩下部分分離出來的皮質(zhì)經(jīng)RNase-Free水處理后，保存在-80℃；右側(cè)腎臟快速在液氮中凍結(jié)后，-80℃保存。

1.2.2 腎臟指數(shù)測(cè)定：取腎后剝?nèi)ブ镜冉M織，用濾紙吸干表面液體，立即稱取右側(cè)每一個(gè)完整腎臟的濕重，并按每100 g體質(zhì)量計(jì)算腎臟指數(shù)［6］。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR：檢測(cè) GAPDH、腎素（renin）、血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）、血管緊張素Ⅱ受體1A亞型（angiotensinⅡreceptor type 1a，AT1AR）、血管緊張素Ⅱ受體1B亞型（angiotensinⅡreceptor type 1b，AT1BR）、血管緊張素Ⅱ受體2亞型（angiotensinⅡreceptor type 2，AT2R）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）、Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ，ColⅠ）、Ⅳ型膠原（collagen typeⅣ，ColⅣ）的基因表達(dá)，通過QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒、TaqMan ABI PRISM 7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）對(duì)來自各組大鼠腎臟皮質(zhì)的cDNA模板進(jìn)行定量擴(kuò)增，所用引物同文獻(xiàn)［7，8］。每次進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)均采用等量的蒸餾水替代模板作為陰性對(duì)照，采用GAPDH作為加樣對(duì)照。所測(cè)目標(biāo)基因mRNA的絕對(duì)值可通過以其GAPDHmRNA含量進(jìn)行校正而獲得。

1.2.4 光學(xué)顯微鏡檢查：10%甲醛固定的腎臟組織，石蠟包埋，3 μm切片，采用PAS和Mass三色染色。通過自動(dòng)圖像處理系統(tǒng)對(duì)PAS和Masson三色染色切片進(jìn)行分析［6，9～11］，評(píng)估腎小球硬化和腎小管纖維化程度。

1.2.5 其他檢查：通過尿蛋白試劑盒和尿肌酐檢測(cè)試劑盒［6］檢測(cè)大鼠尿中白蛋白和尿肌酐濃度；餐后血糖水平測(cè)定采用Wako工業(yè)株式會(huì)社的血糖儀；尿中AGT檢測(cè)采用大鼠AGT的夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法［10］；在腎內(nèi)AngⅡ含量提取過程中，腎內(nèi)組織在冷處理的甲醇中粉碎后，通過放射免疫方法檢測(cè)［6］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般狀況和腎功能的影響

6～30周齡時(shí)，LETO大鼠的平均血壓（91～102 mmHg）和尿白蛋白/尿肌酐的比值（0.6～14.8 mg/g）無明顯變化（圖1A和1B）。糖尿病OLETF大鼠隨著年齡的增長(zhǎng)發(fā)生高血壓（圖1A）；11～30周齡，糖尿病OLETF大鼠的尿白蛋白/尿肌酐的比值明顯高于LETO大鼠（P＜0.05，圖1B）。從7周齡開始，糖尿病OLETF大鼠體質(zhì)量明顯高于LETO大鼠（P＜0.05，表1）。大鼠斷奶后（出生后2周），糖尿病OLETF大鼠右側(cè)腎質(zhì)量/體質(zhì)量的比值明顯高于LETO大鼠（P＜0.05，表1）。18～30周齡時(shí)，糖尿病OLETF大鼠的餐后血糖明顯高于LETO大鼠（P＜0.05，表1）。

2.2 RAS系統(tǒng)成分的改變

腎內(nèi)AngⅡ含量的最高峰出現(xiàn)在糖尿病OLETF大鼠和LETO大鼠出生后第1天，從斷奶前到斷奶后（出生后1 d～4周）隨著年齡增長(zhǎng)逐漸下降。從出生到4周齡，糖尿病OLETF大鼠和LETO大鼠比較，腎內(nèi)AngⅡ含量和RAS組成成分AGT、renin、ACE、AT1AR、AT1BR、AT2R 的基因表達(dá)無明顯改變（P>0.05，圖 2A、2B、2C 和圖 3）。但是從 11周開始，糖尿病OLETF大鼠腎內(nèi)AngⅡ含量明顯高于LETO大鼠（P<0.05），同時(shí)11～30周齡糖尿病OLETF大鼠AGT、renin的mRNA表達(dá)也明顯高于LETO大鼠（P<0.05，圖2B和2C）。糖尿病OLETF大鼠尿中AGT的排泄率與LETO大鼠相比，也從11周開始明顯增加，11周齡時(shí)分別為（358±14）和（80±11）ng/d，18 周齡時(shí)分別為（426±28）和（92±11）ng/d，30周齡時(shí)分別為（487±35）和（103±14）ng/d（均 P<0.05，圖 2D）。無論腎內(nèi) ACE還是 AT1AR和AT1BRmRNA水平，2組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖 3A、3B、3D）。然而，18～30周齡糖尿病OLETF大鼠與LETO大鼠比較，腎內(nèi)AT2RmRNA

水平明顯降低（P<0.05，圖3C）。

表1 2組大鼠2～3 0周齡時(shí)的特征比較Tab.1 Characteristics of each group at 2-30 weeks of age

2.3 腎內(nèi)皮質(zhì)膠原、TGF-β和CTGF基因表達(dá)的改變

腎內(nèi)皮質(zhì)的ColⅠ、ColⅣ、TGF-β和 CTGF的基因表達(dá)如圖4所示，7～30周齡糖尿病OLETF大鼠CTGF基因表達(dá)水平是LETO大鼠2倍（P<0.05，圖4A）；與LETO大鼠比較，糖尿病OLETF大鼠TGF-β基因水平表達(dá)已開始逐漸升高，18～30周齡時(shí)迅速增加（P<0.05，圖4B）。同樣，糖尿病OLETF大鼠與LETO大鼠比較，18～30周齡及11～30周齡時(shí)腎內(nèi)皮質(zhì)的ColⅠ或ColⅣmRNA也分別明顯升高（P<0.05，圖 4C、4D）。另一方面，7～11周齡時(shí) 2組大鼠均無腎內(nèi)免疫形態(tài)學(xué)改變。正如我們前期實(shí)驗(yàn)所見［4］，18～30周齡糖尿病OLETF大鼠才出現(xiàn)了明顯的腎小球硬化和腎小管纖維化。

3 討論

我們?cè)谥暗难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，OLETF糖尿病肥胖大鼠在發(fā)生糖尿病前腎內(nèi)AngⅡ水平從11周已經(jīng)開始顯著增加［4］。但是，我們不清楚在糖尿病OLETF大鼠的成熟過程中，糖尿病早期腎內(nèi)AngⅡ水平是否已經(jīng)開始異常增加。本研究發(fā)現(xiàn)，LETO和糖尿病OLETF大鼠在出生后到斷奶期間（從出生后第1天至4周齡），腎內(nèi)AngⅡ水平在出生后第1天達(dá)到高峰，隨著年齡增長(zhǎng)會(huì)逐漸下降，這與前人對(duì)正常SD大鼠腎內(nèi)RAS的研究結(jié)果一致［12］。在第1天至4周齡，腎內(nèi)AngⅡ水平在糖尿病OLETF大鼠與正常LETO大鼠之間沒有差異。同樣，在青春期開始（7周齡）時(shí)OLETF和LETO大鼠腎內(nèi)AngⅡ水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，在青春期（7～11周齡）期間，LETO大鼠腎內(nèi)AngⅡ水平不斷下降，但是這種下降趨勢(shì)卻沒有在糖尿病前期OLETF大鼠中觀察到。這些數(shù)據(jù)表明，在糖尿病OLETF大鼠的糖尿病早期，腎內(nèi)AngⅡ水平適當(dāng)減少的發(fā)育缺陷會(huì)導(dǎo)致腎臟AngⅡ水平異常升高。

我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病早期短期應(yīng)用血管緊張素受體拮抗劑治療干預(yù)有助于減輕糖尿病OLETF大鼠的腎臟損傷。最近，對(duì)奧美沙坦和預(yù)防微量白蛋白尿的研究（ROADMAP）審查中發(fā)現(xiàn)，血管緊張素受體拮抗劑可以阻止微量白蛋白尿的發(fā)生［13］。這表明，如果2型糖尿病患者早期應(yīng)用血管緊張素受體拮抗劑奧美沙坦治療，可以顯著減少微量白蛋白尿的發(fā)生率［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，在青春期（18～30周齡）糖尿病OLETF大鼠腎內(nèi)AngⅡ水平一直都維持在異常的高水平。這些數(shù)據(jù)支持一個(gè)假設(shè)，即異常的腎內(nèi)AngⅡ水平調(diào)控了2型糖尿病腎病的發(fā)病，而早期應(yīng)用血管緊張素受體拮抗劑治療可能在以后的生活中有效的預(yù)防糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展，具有非常重要的意義。

從出生到斷奶期間（出生后第1天至4周齡），糖尿病OLETF和LETO大鼠腎皮質(zhì)的AGT、ACE和renin基因表達(dá)沒有差異。同樣，在青春期開始（7周齡）時(shí)2組腎內(nèi)RAS組成成分的基因表達(dá)沒有變化。然而到青春期的后期（11周齡），糖尿病OLETF大鼠的AGT和renin基因表達(dá)明顯高于LETO大鼠。巧合的是，這個(gè)時(shí)期的糖尿病OLETF大鼠腎內(nèi)AngⅡ也同樣高于正常LETO大鼠。這些數(shù)據(jù)說明，糖尿病OLETF大鼠腎組織的AGT和reninmRNA異常高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致青春期腎內(nèi)AngⅡ水平異常升高的發(fā)育缺陷。然而，對(duì)于糖尿病大鼠腎內(nèi)AGT和renin基因表達(dá)異常升高的具體病因機(jī)制不是很清楚，但是不能簡(jiǎn)單的歸結(jié)于血糖升高。因?yàn)樘悄虿LETF大鼠表現(xiàn)出腎內(nèi)AGT和renin基因異常高表達(dá)發(fā)生在青春期11周齡的糖尿病前期，早于血糖升高的糖尿病期。另外，糖尿病OLETF和正常LETO大鼠腎皮質(zhì)中AT1受體的AT1AR和AT1BR基因表達(dá)沒有明顯差異。但是AT2R基因在糖尿病OLETF大鼠腎皮質(zhì)中的表達(dá)明顯低于正常LETO大鼠，這些生理、病理變化需要進(jìn)一步的研究。

據(jù)報(bào)道，TGF-β/CTGF所依賴的途徑可以激活包括膠原在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白化合物［14～16］。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于LETO大鼠，OLETF大鼠在青春期（7或11周齡）CTGF、TGF-β和ColⅣ基因表達(dá)明顯增加。另一方面，ColⅠ基因在糖尿病OLETF大鼠18～30周齡時(shí)明顯增加，這與我們過去的研究結(jié)果一致［4］。本研究中，我們沒有觀察到糖尿病OLETF大鼠在青春期11周齡時(shí)腎組織免疫形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，但腎臟功能已經(jīng)輕微改變（如CTGF、TGF-β、ColⅣ），這可能是導(dǎo)致后期糖尿病腎病的重要病理基礎(chǔ)。

總之，本研究表明，糖尿病OLETF大鼠在青春期缺乏維持腎內(nèi)低水平AngⅡ的發(fā)育缺陷是導(dǎo)致腎內(nèi)AngⅡ異常升高的重要原因，與腎內(nèi)AGT和renin基因的高表達(dá)密切相關(guān)。在糖尿病早期，腎內(nèi)RAS異常激活可能是導(dǎo)致以后生活中糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要原因。

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