吳文錦，汪蘭，熊光權(quán)，杜欣，喬宇，廖李，程薇

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工分中心，國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北武漢 430064）

菜籽粕中粗蛋白的含量一般在35%～45%，是一種重要的蛋白質(zhì)飼料資源，且蛋氨酸、精氨酸含量豐富，組成合理，僅賴氨酸含量略低于大豆蛋白，其品質(zhì)可以與豆粕媲美，是一種物美價(jià)廉的蛋白質(zhì)飼料。此外，與大豆餅粕相比，菜籽餅粕還含有較高的膽堿、生物素、煙酸、VB1、VB2和豐富的微量元素如鈣、磷、硒等，特別是其無(wú)機(jī)磷含量較高，便于吸收利用[1－2]。但由于菜籽粕中含有硫甙、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，使其潛在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得不到充分利用。因而菜籽餅粕脫毒是其利用的瓶頸，目前所有菜籽餅粕的脫毒方法有生物脫毒法、物理脫毒法、化學(xué)脫毒法和遺傳育種法[3－5]。

姬松茸是一種食藥兩用真菌，對(duì)基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)換代謝能力。其菌絲體在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化降解大分子結(jié)構(gòu)的能力[6]。蟲草與天然的冬蟲夏草有相似的保健功效。目前利用姬松茸和蟲草固體發(fā)酵菜籽餅粕脫毒的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種食用菌固體發(fā)酵菜籽餅粕脫毒效果進(jìn)行比較，尋求最佳的發(fā)酵條件，為菜籽餅粕的利用開(kāi)辟新途徑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蛋白胨，酵母粉，VB1，硫酸銨，硫酸鎂，磷酸二氫鉀，磷酸二氫鈉，氨水，無(wú)水乙醇，單寧酸，鎢酸鈉，磷鉬酸，碳酸鈉均為分析純。

姬松茸和蟲草菌種：由湖北省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所保存；菜籽餅粕：經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過(guò)28目紗布，保存?zhèn)溆茫恍泵媾囵B(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）；液體搖床發(fā)酵培養(yǎng)基：即馬鈴薯葡萄糖（PDB）。

1.1.2 儀器

SHJ—超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA1104N萬(wàn)分之一天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；DNP－9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化

按照無(wú)菌操作要求將低溫保藏的姬松茸和蟲草菌株轉(zhuǎn)管接種于新制PDA試管斜面，并于26℃下恒溫培養(yǎng)，直到菌絲長(zhǎng)滿斜面。

1.2.2 菌種的復(fù)壯

從1.2.1中PDA試管斜面中挑選長(zhǎng)勢(shì)良好、顏色潔白且菌絲粗壯的一支試管，選取分離活化后培養(yǎng)物的頂端部分，按照無(wú)菌操作要求對(duì)姬松茸和蟲草菌株再次進(jìn)行轉(zhuǎn)管接種于新制的PDA培養(yǎng)基，并于26℃下恒溫培養(yǎng)，直到菌絲長(zhǎng)滿斜面培養(yǎng)基。

1.2.3 液體發(fā)酵

將1.2.2中復(fù)壯后的菌種，按照無(wú)菌操作要求將其接種到滅菌后的PDB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床發(fā)酵，溫度設(shè)定為26℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為170 r/min。觀察菌體生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 固體發(fā)酵

綜合考慮菜籽餅粕量、玉米粉、料液比和酵母粉蛋白胨量（接種量）四個(gè)因素對(duì)發(fā)酵的影響，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，因素水平表見(jiàn)表1與表2。按正交試驗(yàn)要求將培養(yǎng)基裝入500 mL的罐頭瓶中，透氣膜封口，高溫滅菌，按照無(wú)菌操作的要求將1.2.3中發(fā)酵液接種至罐頭瓶中，避光，室溫，濕度75%以上培養(yǎng)，觀察固體發(fā)酵菌絲體生長(zhǎng)狀況。

表1 姬松茸固體發(fā)酵因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal text of agaricus blazei murill solid-state fermentation

表2 蟲草固體發(fā)酵因素水平表Table 2 Factor and level of orthogonal text of cordyceps militaris solid-state fermentation

1.2.5 硫苷的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取粉碎過(guò)60目篩，干燥至恒重試樣0.2000 g（精確至0.001 g）于離心管，加入粗芥子酶（利用白芥子制取，純度達(dá)98%）40 mg，再加入2.0 mL pH 7緩沖溶液，用旋渦式混合器充分混合。將上述混勻后的溶液置于搖床中恒溫培養(yǎng)24 h，搖床溫度設(shè)為35℃，使粗芥子酶充分反應(yīng)。待酶促反應(yīng)結(jié)束后，向水解液中加入2.5 mL二氯甲烷，用旋渦式混合器混合均勻，并在室溫下振蕩0.5 h，以便水相、有機(jī)相、樣品充分混合。然后將離心管置于離心機(jī)中，在4 000 r/min條件下離心20 min。分別取6 mL乙醇（測(cè)OZT）或80%氨乙醇（測(cè)ITC）于具塞試管中，用微量進(jìn)樣器分別取離心管下層有機(jī)相50 μL，加入到裝有無(wú)水乙醇或氨乙醇的具塞試管中，用旋渦式混合器混合均勻后，將具塞試管放入水浴鍋，在50℃下加熱0.5 h，取出冷卻至室溫。在紫外分光光度計(jì)上用10 mm石英比色皿，分別在235、245、255 nm處測(cè)定其樣品的光密度值?？瞻讓?shí)驗(yàn)于離心管，加入粗芥子酶60 mg，其余步驟同試樣測(cè)試。

式中：OZT為試樣中惡唑烷硫酮的含量，（mg/g）；吸光值均取自于乙醇溶液；ITC為試樣中異硫氰酸酯的含量，（mg/g），吸光值均取自于氨乙醇溶液；OD235為試樣中235 nm處光密度值；OD245為試樣中245 nm處光密度值；OD255為試樣中255 nm處光密度值[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 姬松茸固體發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)菌種的長(zhǎng)勢(shì)、菌絲濃密程度、萌發(fā)速度、菌絲的潔白度等指標(biāo)打分，滿分為100分，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3的直觀分析可知，姬松茸的最佳發(fā)酵條件為A2B2C1D2，即菜籽餅粕30 g，玉米粉10 g，酵母粉蛋白胨3 g，料液比是 4∶1（g/mL），由極差分析可知影響發(fā)酵效果的順序?yàn)椋毫弦罕龋居衩追郏静俗扬炂桑窘湍阜酆偷鞍纂恕?/p>

表3 姬松茸固體發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 3 Result of orthogonal test of agaricus blazei murill solid-state fermentation

在菜籽餅粕30 g，玉米粉10 g，酵母粉蛋白胨3 g，料液比是4∶1（g/mL）的條件下固體發(fā)酵姬松茸菌種菌絲長(zhǎng)勢(shì)良好，菌絲濃密，菌絲潔白，萌發(fā)速度快。

2.2 蟲草固體發(fā)酵菜籽餅粕正交試驗(yàn)分析

根據(jù)菌種的長(zhǎng)勢(shì)、菌絲濃密程度、萌發(fā)速度、菌絲的潔白度等指標(biāo)打分，滿分為100分，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 蟲草固體發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 4 Result of orthogonal test of of cordyceps militaris solidstate fermentation

由表4的直觀分析可知，蟲草發(fā)酵的最佳條件為A2B2C3D2即菜籽餅粕60 g，玉米粉3 g，料液比5∶1（g/mL），接種量8 mL，由極差分析可知影響發(fā)酵效果的順序?yàn)椋毫弦罕龋静俗扬炂桑居衩追郏窘臃N量。

在菜籽餅粕 60 g，玉米粉 3 g，料液比 5∶1（g/mL），接種量8 mL條件下固體發(fā)酵蟲草，菌種菌絲長(zhǎng)勢(shì)良好，菌絲濃密，菌絲潔白，萌發(fā)速度快。

2.3 硫苷含量的測(cè)定

待菌絲不能生長(zhǎng)后，挑選出姬松茸和蟲草固體發(fā)酵較好的三組進(jìn)行硫苷含量的測(cè)定測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表5。

表5 硫苷含量測(cè)定結(jié)果Table 5 Result of glucosinolates

由表5可知，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后異硫氰酸酯的含量均有下降，姬松茸和蟲草發(fā)酵效果相當(dāng)，姬松茸固體發(fā)酵對(duì)惡唑烷硫酮有較強(qiáng)的降解效果，蟲草固體發(fā)酵對(duì)惡唑烷硫酮效果較差。

3 結(jié)論

姬松茸的最佳發(fā)酵條件為菜籽餅粕30 g，玉米粉10 g，酵母粉蛋白胨3 g，料液比是4∶1，由極差分析可知影響發(fā)酵效果的順序?yàn)椋毫弦罕龋居衩追郏静俗扬炂桑窘湍阜鄣鞍纂恕?/p>

蟲草發(fā)酵的最佳條件為菜籽餅粕60 g，玉米粉3 g，料液比 5∶1（g/mL），接種量 8 mL，由極差分析可知影響發(fā)酵效果的順序?yàn)椋毫弦罕龋静俗扬炂桑居衩追郏窘臃N量。

本試驗(yàn)中姬松茸和蟲草只是處在菌絲體生長(zhǎng)階段，從菌絲體的生長(zhǎng)狀況看，通過(guò)改善后期發(fā)酵條件可以培養(yǎng)出兩種子實(shí)體。若能利用菜籽餅粕固體發(fā)酵培養(yǎng)出姬松茸或蟲草的子實(shí)體，不僅可以達(dá)到脫毒的目的，還可以將發(fā)酵后的菜籽餅粕轉(zhuǎn)化為功能性飼料，為菜籽餅粕的利用開(kāi)辟新的途徑。因而利用姬松茸或蟲草發(fā)酵菜籽餅粕脫毒具有重要的意義，是一個(gè)值得探索的課題。

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[3]周愛(ài)東,楊紅曉,賀祝.菜籽餅粕脫毒及菜籽蛋白提取的研究進(jìn)展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(1):97－99

[4]張獻(xiàn)仁.應(yīng)用生物蛋白飼料生產(chǎn)綠色食品——固態(tài)發(fā)酵脫毒菜粕介紹[J].江西飼料,1996(1):15－17

[5]李文林,黃風(fēng)洪,彭健,等.脫皮雙低菜籽粕的開(kāi)發(fā)和飼用研究[J].中國(guó)油脂,2006,31(3):51－58

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[7]溫魯,夏敏,宋虎衛(wèi),等.固體培養(yǎng)蛹蟲草核苷類次生代謝物的產(chǎn)率[J].食品科學(xué),2005,26(11):65－68