王曉英

（吉林工商學院食品工程分院，吉林長春 130062）

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand-Mazz）是一種常見的藥食兩用植物，具有廣譜的抑菌作用，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和病毒都有不同的抑制作用，蒲公英黃酮類提取物和其中的蘆丁有較強的體外清除超氧陰離子的能力[1]，蒲公英對金黃色葡萄球菌耐藥菌株、溶血性鏈球菌及肺類雙球菌、腦膜炎球菌、白喉桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌等均有一定的殺菌作用[2]，而且蒲公英野生資源極為豐富。

本文以冷鮮肉中典型的革蘭氏陰性腐敗菌假單胞菌為檢測對象，通過測定蒲公英總黃酮類提取物與假單胞菌作用前后細菌培養(yǎng)液的電導率、可溶性糖類及蛋白質(zhì)表達方面的變化，較全面地考查蒲公英黃酮類提取物對假單胞菌體細胞膜和細胞內(nèi)分子代謝的影響作用，為蒲公英總黃酮類提取物用于冷鮮肉的涂膜保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

UV-7502PC紫外可見分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；YXQ-LS-18SI手提式高壓滅菌鍋：上海涵今儀器儀表有限公司；HPX-9052A電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司；BANTE950型精密電導儀：上海理達儀器廠；318C酶標儀：上海精科分析儀器廠。

1.2 材料

1.2.1 原料

蒲公英：采自吉林省長春市雙陽區(qū)田間的野生蒲公英，采集時間，2011年9月。

1.2.2 供試菌種

假單胞菌：由吉林工商學院食品工程分院微生物實驗室保存。

1.2.3 培養(yǎng)基

瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨20g，蒸餾水1L，氧化鎂1.4g，硫酸鉀 1.0 g，瓊脂 13.6 g，甘油 10 mL，pH7.2，121 ℃滅菌15 min。28℃條件下48 h。

1.3 蒲公英抑菌成分的提取

采用水提法，二級浸提的方式。將干燥后的蒲公英全草，經(jīng)過粉碎機粉碎，加入20倍量的水，80℃水浴回流浸提30 min。重復提取2次，用4層紗布過濾，合并提取液。按此工藝得到的蒲公英中的總黃酮提取物總量分別為：1.51 g/L?？傸S酮類含量的測定方法采用李立順等[3]的方法。

1.4 蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌的抑菌試驗（K-B紙片擴散法）

將假單胞菌在培養(yǎng)基上活化后，用滅菌生理鹽水配成含菌數(shù)106cfu/mL～107cfu/mL的菌懸液備用。一般挑取純化的大小適中的菌落2個，無菌操作，加入9 mL生理鹽水中，攪拌均勻。將厚度為1.5 mm的濾紙用打孔器制成直徑為6 mm的濾紙片，放入培養(yǎng)皿中，121℃高壓滅菌30 min，然后在100℃烘干，備用。將配制好的滅菌培養(yǎng)基冷卻至50℃～60℃，傾注于干熱滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，制成平板[4]。用無菌移液管分別吸取0.1 mL供試菌懸液于固體培養(yǎng)基平板中，用無菌三角玻璃涂棒，將菌懸液在瓊脂培養(yǎng)基上均勻涂布。將濾紙片置于不同濃度的蒲公英總黃酮類提取物稀釋液中，浸泡30 min，取出，30℃烘干制成藥敏紙片，備用。把制備好的藥敏紙片等距離放入含菌平板內(nèi)壓實，每個平板放4個藥敏片，4℃作用2 h后，將平板倒置放入培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，測量各藥敏片的抑菌環(huán)直徑大小[6]。以蒸餾水作為空白對照。

1.5 蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌最小抑菌濃度（MIC）的測定

按1.4所示方法制備假單胞菌菌懸液。將蒲公英總黃酮類提取物用無菌蒸餾水稀釋成不同濃度的受試液，使其濃度分別為：1.5、0.75、0.375、0.187 5、0.093 75 mg/mL。取各稀釋度受試液加入到瓊脂培養(yǎng)基中，取0.1 mL含菌量為106cfu/mL～107cfu/mL試驗菌懸液接種于含蒲公英提取液的瓊脂培養(yǎng)基中作為試驗樣本，另設蒸餾水做陽性對照樣本，將試驗組樣本、陽性對照組樣本放置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

1.6 蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌的抑菌機理的研究

1.6.1 蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌細胞膜通透性的影響

活化假單胞菌，28℃振蕩培養(yǎng)，菌液濃度調(diào)到106cfu/mL～107cfu/mL，取適量菌液，加入蒲公英提取液使其最終總黃酮濃度為0.75 mg/mL，用無菌水代替蒲公英提取液作對照組，每隔10 min測一次培養(yǎng)菌液的電導率，平行實驗三次，以確定金屬離子的滲出的變化趨勢。

1.6.2 蒲公英總黃酮類提取物對培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度的影響

活化假單胞菌，28℃振蕩培養(yǎng)，菌液濃度調(diào)到106cfu/mL～107cfu/mL，取適量菌液，加入蒲公英提取液使其最終總黃酮類提取物的濃度為0.75 mg/mL，用無菌水代替蒲公英提取液作對照組，每隔1 h測定培養(yǎng)菌液中蛋白質(zhì)含量（Bradford法）[4]。

1.6.3 蒲公英總黃酮類提取物對培養(yǎng)液中總糖的影響

活化假單胞菌，28℃振蕩培養(yǎng)，取適量菌液，加入蒲公英提取液使其最終總黃酮類提取物的濃度為0.75 mg/mL，分別在 0、1、2、4、6、8、10、12 h 取 1 mL 混合液離心（11 000 r/min，2 min），取上清液稀釋5倍后，取50 μL置離心管中，加入200 μL蒽酮試劑，迅速置冰浴中，冷卻5 min，再置沸水浴中準確煮沸10 min，通過酶標儀測其在620 nm處吸光度，以標準葡萄糖溶液作標準曲線，用無菌水代替蒲公英提取液作空白對照組，平等實驗三次[5]。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌的抑菌效果

蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌的抑菌效果見表1。

蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌有顯著的抑菌效果，而且隨著蒲公英提取液中總黃酮類提取物的濃度的增加抑菌效果明顯增強。

表1 不同濃度的蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌的抑菌效果Table 1 The antimicrobial effect of extractions of total flavonoids from Taraxacum mongolicum Hand-Mazz against pseudomonad for different concentration

2.2 蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌最小抑菌濃度

不同濃度的蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌的最小抑菌濃度見表2。

表2 不同濃度蒲公英總黃酮類提取物最小抑菌濃度試驗Table 2 The experiments on the minimal antimicrobial concentration of total flavonoids in Taraxacum mongolicum Hand-Mazz extract with different concentration

由表2可知蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）為總黃酮類含量3.125×10－2mg/mL。

2.3 蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌抑菌機理的研究

2.3.1 蒲公英總黃酮類提取物對假單胞菌細胞膜通透性的影響

表3顯示了經(jīng)蒲公英提取液處理不同時間后，假單胞菌菌液的電導率的測定結(jié)果。

表3 蒲公英總黃酮類提取液處理后假單胞菌菌液的電導率變化Table 3 Changes in electric conductivity of broth for Pseudomonad treated by of total flavonoids from Taraxacum mongolicum Hand-Mazz

由表3可知，經(jīng)蒲公英提取液處理的假單胞菌的培養(yǎng)液的電導率明顯高于對照組，而且隨著作用時間的延長，培養(yǎng)液的電導率持續(xù)增加，說明當細菌遇到抑菌劑而使細胞膜遭到破壞時，菌體的細胞膜屏障打破，導致其電解質(zhì)外泄至培養(yǎng)液中，進而使培養(yǎng)液的電導率上升。

2.3.2 蒲公英總黃酮類提取物對培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度的影響

蒲公英總黃酮類提取物對培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度的影響見表4。由表4可知，蒲公英提取液對假單胞菌的細胞膜滲透壓影響顯著，添加蒲公英提取液6 h后的假單胞菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度：242.62 μg/mL，對照培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度：51.12 μg/mL。其主要原因是由于蒲公英提取液中的總黃酮類物質(zhì)可以改變細菌細胞膜的通透性，導致蛋白質(zhì)滲透到菌體外的培養(yǎng)液中。

表4 蒲公英總黃酮類提取液處理后假單胞菌菌液蛋白質(zhì)濃度變化Table 4 Changes in total proteins concentration of broth for Pseudomonad treated by of total flavonoids from Taraxacum mongolicum Hand-Mazz

2.3.3 蒲公英總黃酮類提取物對培養(yǎng)液中總糖的影響蒲公英總黃酮類提取物對培養(yǎng)液中總糖的影響見表5?？芍敿賳伟c蒲公英提取液（總黃酮類提取物濃度為0.75 mg/mL）作用后，隨著作用時間的延長，培養(yǎng)液中總糖的濃度逐漸上升，說明細菌的細胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細胞內(nèi)的糖類物質(zhì)漸漸滲透至細胞外。由于細菌在正常增殖過程中需要利用培養(yǎng)基中的糖類物質(zhì)，因而對照組培養(yǎng)液中總糖濃度呈下降趨勢。3 結(jié)論

表5 蒲公英總英酮類提取液處理后假單胞菌菌液中總糖濃度變化Table 5 Changes in total sugar concentration of broth for Pseudomonad treated by of total flavonoids from Taraxacum mongolicum Hand-Mazz

蒲公英提取液中總黃酮類提取物含量為3.125×10-2mg/mL時，能抑制假單胞菌的生長，而且隨著蒲公英提取液中總黃酮提取物濃度增大抑菌效果逐漸增強。用總黃酮類提取物濃度為0.75 mg/mL的蒲公英提取液處理假單胞菌菌液時，會加速破壞細胞膜的完整性，導致金屬離子、蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)的滲出，使細胞代謝率亂，最終使細胞死亡，從而起到抑菌作用。

蒲公英分布廣泛，野生資源極為豐富，價格低廉，毒副作用小，具有廣譜抗菌作用，因此，蒲公英是理想的天然食品防腐劑[7]。以蒲公英為原料提取天然冷鮮肉的保鮮劑市場前景廣闊。

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[1]陳景耀,龔祝南,宰學明,等.蒲公英提取物黃酮類物質(zhì)成分及其抗氧化活性的初步研究[J].中國野生植物資源,2001,20(3):22-23

[2]陸海峰,羅建華,蒙春越,等.蒲公英黃酮提取及對羥自由基清除作用[J].廣州化工,2009,37(3):101-103

[3]李立順,時維靜,關(guān)鳴,等.四倍體蒲公英活性成分比較及體外抑菌作用研究[J].中國實驗方劑學雜志,2008,14(6):55-58

[4]孫京新,王文娟.茶多酚對假單胞菌抑制機理的研究[J].肉類工業(yè),2010(1):36-39

[5]錢麗紅,陶研,謝晶.茶多酚對金黃葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機制[J].微生物學通報,2010,37(11):1628-1633

[6]宋毓民.蒲公英抑菌成分的分離與鑒定[D].陜西:西北農(nóng)林科技大學,2006:21

[7]鐘振聲,黃景怡.蒲公英等五種常見中草藥的抑菌研究[J].現(xiàn)代食品科技,2007,23(6):15-16