章立群，孫 輝，鄧碧霞，謝安琪

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山人民醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518052)

防止牙-牙周組織切片脫片技術(shù)的改進

章立群，孫 輝，鄧碧霞，謝安琪

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山人民醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518052)

目的 探討一種可有效防止牙-牙周組織切片脫片的方法。方法改進組采用APES涂膠玻片，在抗原修復(fù)前在組織切片上覆蓋同等大小紗布和空載玻片，回形針固定。對照組使用普通玻片，烤片過夜，常規(guī)脫蠟水化。比較改進組和對照組各40張切片在煮沸法、酶抗原修復(fù)后脫片率，并用PCNA檢驗其染色效果。結(jié)果改進組脫片率較對照組明顯降低(P＜0.01)。煮沸法抗原修復(fù)后PCNA染色有核染陽性細胞散在存在于組織中，背景清晰，效果滿意。胰酶修復(fù)法兩組均未出現(xiàn)陽性表達。結(jié)論該改進的方法能有效防止牙-牙周組織脫片并不影響染色效果，值得推廣應(yīng)用。

抗原修復(fù)；牙周組織；免疫組化

牙-牙周組織切片在口腔醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，但由于其中硬組織含鈣多，堅硬致密，為難切硬脆、易碎組織；其軟組織也易受擠壓、牽拉而發(fā)生脫落[1]。免疫組化是醫(yī)學(xué)研究和臨床病理常用方式之一，抗原修復(fù)是其中重要步驟。牙-牙周組織切片經(jīng)過抗原修復(fù)尤其是高溫修復(fù)后，容易大量脫片，尤其是硬組織部分，使牙-牙周結(jié)構(gòu)遭到破壞，對結(jié)果分析和實驗進程造成很大困擾。本文旨在探討一種可有效防止牙-牙周組織脫片的方法，并用增殖細胞核抗原(PCNA)染色檢測該方法對染色效果的影響。

1 材料與方法

1.1 組織來源 5個月左右成年SD大鼠10只，雄性，體重200～250 g(上海交通大學(xué)第九人民醫(yī)院SPF動物房提供)。頸椎脫位法處死后立即取出下頜前牙-牙周組織塊(包括牙齦、牙槽骨、牙齒)，10%福爾馬林固定24 h后，10%EDTA脫鈣1個月，常規(guī)固定，脫水、透明、浸蠟、包埋，沿著切牙近遠中向連續(xù)切片，片厚4 μm。

1.2 儀器與試劑 三角牌電飯鍋；格蘭仕微波爐；APES涂膠玻片(上海復(fù)旦臨床病理診斷中心提供)；0.05 mol/L Tris-1 mmol/L EDTA緩沖液(簡稱Tris-EDTA，自配，pH 9.0)；0.125%胰蛋白酶修復(fù)液(自配，pH 8.4)；鼠抗人PCNA一抗(1：50，Chemicon，USA)；羊抗鼠二抗(Invitrogen，USA)；DAB顯色系統(tǒng)(DAKO，USA)。

1.3 方法和分組 改進組(I組)：采用APES涂膠的牙-牙周組織切片40張；60℃烤片30 min，常規(guī)脫蠟水化，將紗布四層剪成和切片同等大小，于抗原修復(fù)前直接覆蓋于組織切片上，同時再覆蓋另一張干凈空載玻片，兩層玻片間的距離為約為4 mm，用回形針將兩層載玻片夾在一起，形成組織切片-紗布-空載玻片的三層結(jié)構(gòu)，放置紗布過程在緩沖液中進行，以避免氣泡生成。按照常見的抗原修復(fù)方式分兩組，每組切片30張；a.煮沸法：Tris-EDTA緩沖液，電飯鍋煮沸修復(fù)20 min；b.胰酶法：37℃，0.125%胰酶修復(fù)20 min。對照組(C組)：普通牙-牙周組織切片40張，60℃烤片過夜，常規(guī)脫蠟水化。組織切片直接放入相應(yīng)的緩沖液中，按抗原修復(fù)方式同法分a、b兩組，每組切片30張。

1.4 染色 抗原修復(fù)后，選a、b各組內(nèi)脫片程度最輕的切片各10張，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，1%牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min；滴加一抗4℃過夜，滴加二抗30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。其余切片常規(guī)用HE蘇木素染色，鏡下觀察組織破壞情況。

1.5 圖象分析 Axioskop 2 plus(Zeiss，German)觀察結(jié)果，并攝片分析。

1.6 脫片統(tǒng)計 按脫片程度分為三個等級：輕度為10%以內(nèi)的組織發(fā)生卷疊或脫落；中度為超過10%但低于50%的組織發(fā)生卷疊或脫落；重度為超過50%以上的組織發(fā)生卷疊或脫落。計算兩組各級別切片數(shù)量。

2 結(jié)果

改進組50%以上總貼片率高于對照組，尤其是高溫煮沸法最為顯著，兩者比率相差90%。對照組切片煮沸法抗原修復(fù)后18片發(fā)生重度脫片，HE染色后鏡下觀察大部分切片硬組織部分包括牙齒、牙槽骨脫片現(xiàn)象嚴(yán)重,軟組織也發(fā)生卷疊或脫落，無法觀察到完整牙-牙周組織（圖1a）。改進組脫片率明顯降低，煮沸法中僅1片切片發(fā)生重度脫片，HE染色鏡下可見牙-牙周組織仍較完整，僅有部分切片牙齒和硬組織結(jié)構(gòu)發(fā)生卷疊（圖1b）。胰酶消化法在兩組中脫片率均很低，但對照組仍有2片的切片發(fā)生中度硬組織脫落或卷疊現(xiàn)象（表1）。

圖1 抗原修復(fù)后組織貼附情況(×12.5)

表1 改進組和對照組在不同抗原修復(fù)方式下的脫片情況(張)

PCNA表達定位于細胞核，以胞核棕黃色顆粒為陽性。對照組牙周結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，牙齒卷疊，但未脫落的牙齦組織染色結(jié)果和改進組相似，同為基底層牙齦陽性染色，結(jié)締組織內(nèi)散在核染陽性細胞(圖2a)；改進組中煮沸法和微波法修復(fù)后染色結(jié)果相似，上皮基底層和上皮下結(jié)締組織有多數(shù)散在的細胞核呈陽性表達，背景清晰，結(jié)果滿意(圖2b)。胰酶修復(fù)法在對照組(圖2c)和改進組(圖2d)中均未出現(xiàn)陽性表達。

圖2 PCNA染色結(jié)果(×200)

3 討 論

組織經(jīng)甲醛固定后，固定液中的醛基和組織中抗原蛋白氨基交聯(lián)形成羧甲基，使構(gòu)象決定簇折疊排列的三維建構(gòu)發(fā)生改變，形成空間障礙。同時抗原和其他分子間發(fā)生交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而使不少抗原決定簇被封閉[2]?？乖迯?fù)的目的即使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復(fù)，使抗體獲得更好的染色效果，是免疫組化染色中重要的步驟之一。目前常用的抗原修復(fù)方式主要包括兩種，一種是熱修復(fù)法包括：電飯鍋煮沸法、微波熱修復(fù)法、高壓鍋熱修復(fù)法等；另一種為酶修復(fù)法，常用的有胰酶和胃蛋白酶等。本實驗選用了比較常用的煮沸修復(fù)和胰酶修復(fù)法作為抗原修復(fù)方式，比較改進組和對照組在兩種抗原修復(fù)方式后的脫片及PCNA染色情況。

牙-牙周組織切片是口腔免疫組化研究中染色中常用切片之一，在熱修復(fù)過程中，尤其是在高pH值的緩沖液里，由于熱作用、氣泡和液體的沖刷以及液體堿性的提高，直接將切片浸入修復(fù)液中修復(fù)的方式脫片率相當(dāng)高，尤其是牙齒、牙槽骨等硬組織，剩余的組織也易發(fā)生大面積卷疊現(xiàn)象，難以獲得完整的組織結(jié)構(gòu)和滿意的染色結(jié)果。用紗布直接覆蓋住的組織切片有以下幾個優(yōu)點：1)能有效固定組織，防止熱修復(fù)過程中氣泡和液體流動對組織產(chǎn)生的沖刷作用；2)兩層載玻片之間的間隔以及紗布本身的通透性可以使組織充分和緩沖液接觸并傳導(dǎo)熱量，并不會影響抗原修復(fù)的效果。本實驗中的結(jié)果表明改進方法后牙-牙周組織脫片率大大降低，基本可保持完整的牙-牙周結(jié)構(gòu)，滿足鏡下觀察要求。PCNA染色結(jié)果也說明，該改進方法并不會對染色結(jié)果產(chǎn)生影響。

不同抗體有各自最適合的修復(fù)方式，對大部分抗體而言酶消化法很難獲得滿意的效果，其中一些難檢測的抗原、細胞核表達的抗原如ER、PR、Ki-67等熱修復(fù)效果更好。史金娜等[3]曾報道認(rèn)為高熱修復(fù)法組織脫片率高，僅適合牙齦乳頭或牙髓等局部軟組織，而酶消化法由于脫片率低，因而不失為目前牙-牙周組織聯(lián)合切片進行免疫組化染色較理想的抗原修復(fù)方法。本研究中所使用的PCNA抗體與DNA合成關(guān)系密切，是評價細胞增殖活性的可靠指標(biāo)，通常用來檢測細胞增殖活性，有較廣的應(yīng)用價值[4]。雖然經(jīng)過胰酶消化處理后的組織切片脫片率很低且牙-牙周結(jié)構(gòu)完整，但其PCNA染色均無出現(xiàn)任何陽性結(jié)果，說明對某些抗體而言酶消化法并不能完全適用。對于含硬組織的切片，必須進行高熱法抗原修復(fù)時，采用有效防脫片措施。

常用的防脫片法主要是玻片處理后涂布氨醛酸乙基硅(APES)或多聚-L-賴氨酸(PLLS)、烤片時間超過5 h等，但含有硬組織的切片即使做以上處理，在高熱修復(fù)時仍不能達到滿意的效果，尤其是牙-牙周這樣比較細微的組織結(jié)構(gòu)。此外高pH值的抗原修復(fù)液雖可獲得較好的修復(fù)效果，但也更易使組織脫片[5]。本實驗中采用涂APES的組織切片，并采用切片-紗布-空載片的方法，只需烤片半個小時左右，大大縮短了操作時間，提高效率。并且在高pH值的修復(fù)液中經(jīng)高溫修復(fù)也能使大部分組織和切片貼附并保持牙-牙周組織的基本完整，不影響染色效果，值得推廣應(yīng)用。但同時本方法也存在不足之處，如操作過程需要謹(jǐn)慎仔細以防損傷組織結(jié)構(gòu)、高熱修復(fù)后仍然存在部分硬組織發(fā)生卷疊現(xiàn)象等，如何發(fā)現(xiàn)更好的防脫片法還有待進一步探索研究。

[1]王 渝,臧光祥,孫宏晨,等.提高牙及牙周組織聯(lián)合石蠟切片質(zhì)量的探討[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志[J].2005,40(5):437-438.

[2]熊正文.免疫組化技術(shù)中抗原修復(fù)的進展[J].中華病理學(xué)雜志, 1997,26(2):124-125.

[3]史金娜,李永恒,馬 肅,等.兩種抗原修復(fù)法對牙-牙周免疫組化切片的影響[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2007,23(3):261-263.

[4]Akui S,Furusata M,Itoh T,et al.Tumor angiogenesis in prostatic carcinoma with and wlthout bone marrow metastasis:a morphometric study[J].J Pathol,1992,168(2):257-262.

[5]杜娟石,雪 迎,鄭 杰,等.抗原修復(fù)液pH值及修復(fù)時間對免疫組化染色效果的影響[J].北京大學(xué)學(xué)報,2005,37(2):195-196.

Technological improvement on the prevention of dento-periodontal tissue section from separating from slices.

ZHANG Li-qun,SUN Hui,DENG Bi-xia,XIE An-qi.
Department of Stomatology,Nanshan People’s Hospital Affiliated to Guangdong Medical University,Shenzhen 518052,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo find out an effective way to prevent the dento-periodontal tissue from separating from the slices.MethodsIn the improvement group,a blank slice and gauze with the same size as the slice were used to cover the tissue,and paperclip was used to clip them together.Ordinary slides were used in the control group. The ratio of tissue separating from the 40 slices of each group was calculated and compared after boiling or enzymatic digestion antigen retrieval method.Immunohistochemical staining of PCNA was used to detect the effect of coloration.ResultsThe ratio of tissue dropping from the slices in the improvement group was lower than that in the control group.PCNA staining also showed positive cell nucleus scattered in the tissues with clear background.No positive cells were seen in the tissue after enzymatic digestion in the two groups.ConclusionThe improved technique is helpful in the prevention of dento-periodontal tissue section from separating from slices,with no negative effect on the immunohistochemical results.

Antigen retrieval;Dento-periodontal tissue;Immunohistochemical method

R-332

A

1003—6350(2012)13—015—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.13.007

2012-02-16)

章立群(1980—)，女，安徽省銅陵市人，主治醫(yī)師，博士。