凡琳琳，談 順*，饒 翔，張英愛，王識(shí)華

(中南大學(xué)湘雅?？卺t(yī)院病理科1、中心實(shí)驗(yàn)室2，海南 ?？?570208；海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院病理科3，海南 三亞 572000)

·論 著·

PTCL石蠟組織中HTLV-I感染情況的初步研究

凡琳琳1，談 順1*，饒 翔1，張英愛2，王識(shí)華3

(中南大學(xué)湘雅?？卺t(yī)院病理科1、中心實(shí)驗(yàn)室2，海南 ?？?570208；海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院病理科3，海南 三亞 572000)

目的檢測(cè)外周T細(xì)胞淋巴瘤石蠟包埋組織中HTLV-1感染情況以了解外周T細(xì)胞淋巴瘤(PTCL)各類型與人類T細(xì)胞淋巴瘤病毒Ⅰ型(HTLV-1)的關(guān)系。方法根據(jù)2008年WHO分類法對(duì)46例外周T細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行分類，提取外周T細(xì)胞淋巴瘤石蠟組織中人基因組DNA，用PCR方法檢測(cè)HTLV-1前病毒。結(jié)果收集到的46例外周T細(xì)胞淋巴瘤石蠟組織中HTLV-1陽性8例，其中HTLV-1在外周T細(xì)胞淋巴瘤，非特殊型(PTCL-U)、NK/T細(xì)胞淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)、成人T細(xì)胞淋巴瘤中(ATLL)中HTLV-1的檢出率分別為15%、8%、10%、75%。結(jié)論外周T細(xì)胞淋巴瘤存在HTLV-1感染，HTLV-1除與ATLL有密切關(guān)系外，與其他類型外周T細(xì)胞淋巴瘤也有一定關(guān)系。

外周T細(xì)胞淋巴瘤；HTLV-1；石蠟包埋組織

外周T細(xì)胞淋巴瘤(Peripheral T cell lymphoma，PTCL)是起源于成熟細(xì)胞或稱胸腺后細(xì)胞的惡性腫瘤。廣義上的PTCL包括除T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋巴瘤/白血病以外的所有T/NK細(xì)胞淋巴瘤。外周T細(xì)胞淋巴瘤是一組具有很強(qiáng)異質(zhì)性的疾病的總和，其病因尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)與免疫缺陷、病毒感染、基因突變等有關(guān)。近年來人類T細(xì)胞淋巴瘤病毒1(Human T cell lymphotropic virus type 1，HTLV-1)與外周T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系備受關(guān)注，國內(nèi)外學(xué)者幾乎都以患者血液樣本作為實(shí)驗(yàn)材料，罕見應(yīng)用石蠟包埋瘤組織進(jìn)行研究，為進(jìn)一步探討外周T細(xì)胞淋巴瘤與HTLV-1之間的關(guān)系，我們將收集到的經(jīng)石蠟包埋的46例外周T細(xì)胞淋巴瘤依據(jù)2008年WHO分類標(biāo)準(zhǔn)[1]進(jìn)行分類，并運(yùn)用PCR方法檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集海口市人民醫(yī)院、海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及農(nóng)墾三亞醫(yī)院病理科自1995-2010年診斷為外周T細(xì)胞淋巴瘤的石蠟組織，經(jīng)高年資醫(yī)師閱片并結(jié)合免疫組織化學(xué)結(jié)果最終篩選出外周T細(xì)胞淋巴瘤46例，并依據(jù)2008年WHO最新分類對(duì)所篩選出的外周T細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行分類，HTLV-1陽性的人基因組DNA(廈門大學(xué)熊君輝博士提供)作為陽性對(duì)照，淋巴結(jié)反應(yīng)性增生石蠟組織作為陰性對(duì)照，PCR試劑盒(天根生化科技有限公司)，PCR引物合成按參考文獻(xiàn)[2]擴(kuò)增產(chǎn)物為326 bp(見表1)由生工生物(上海)有限公司合成。

表1 兩對(duì)特異性引物

1.2 方法

1.2.1HTLV-1 DNA抽提 石蠟組織DNA抽提參照文獻(xiàn)[3]，每例標(biāo)本在HE切片對(duì)照下，選取病變區(qū)域，以消毒刀片挑取約6 mm×3 mm×0.5 mm大小的石蠟組織塊一片，小心置于0.2 ml PCR管中，并加入1×PCR緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L KCl，pH 9.0)50 μl，以加樣槍頭碎裂組織片。100℃加熱15 min，13 200 r/min離心5 min，吸取蠟層與組織片之間的澄清液作為DNA粗提產(chǎn)物作模板。

1.2.2HTLV-1前病毒DNA的PCR法檢測(cè) DNA粗提產(chǎn)物8 μl、10×Taq buffer 5 μl、dNTP混合物(2.5 mmol)4 μl、兩種引物各10 μmol/ml、Taq酶(2.5 U/μl)0.5 μl，加水補(bǔ)至50 μl，混勻，石蠟油覆蓋。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸7 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化、克隆及測(cè)序 取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物加6×2 μl上樣緩沖液于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳(120 V，30 min)，對(duì)照標(biāo)志物無誤后，切下特異性條帶，用膠回收試劑盒(天根)回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆入PGM-T載體(天根)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top菌株。并由本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雙向序列測(cè)定。

2 結(jié) 果

依據(jù)2008年WHO分類，我們所收集到得46例T細(xì)胞淋巴瘤具體分類見表2，PCR檢測(cè)46例外周T細(xì)胞淋巴瘤中HTLV-1陽性8例(占17.39%)，不同類型的外周T細(xì)胞淋巴瘤中HTLV-1的檢出率不同，在外周T細(xì)胞淋巴瘤非特殊型(PTCL-U)、NK/T細(xì)胞淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)、成人T細(xì)胞淋巴瘤中(ATLL)中HTLV-1的檢出率分別為15%、、10%、75%。

表2 外周T細(xì)胞淋巴瘤中HTLV-1的檢測(cè)(n=46)

用部分PCR產(chǎn)物1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，在326 bp處有一條清晰的條帶，與陽性對(duì)照一致?；厥誔CR產(chǎn)物，克隆入T載體并測(cè)序后證實(shí)是HTLV-1前病毒DNA的pX區(qū)的部分序列。

圖1 T細(xì)胞淋巴瘤石蠟組織中HTLV-1前病毒PCR檢測(cè)的部分結(jié)果

3 討論

HTLV-1是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并整合到人類基因組DNA上，位于pX區(qū)的TAX基因在該病毒的致病過程中發(fā)揮重要作用，主要導(dǎo)致人類T細(xì)胞淋巴瘤(ATLL)，因此本實(shí)驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)[2]合成了針對(duì)TAX部分基因片段的兩對(duì)引物。該病毒具有傳染性并呈地域流行，主要流行于日本西南部，在我國的福建和廣東的沿海地區(qū)有局部小流行[4]，海南地理及氣候環(huán)境與廣東相似，因而海南是否也存在HTLV-1流行引起關(guān)注。

本研究通過收集海南省三家醫(yī)院病理科診斷為外周T細(xì)胞淋巴瘤的石蠟組織并依據(jù)2008年WHO分類，收集到的46例外周T細(xì)胞淋巴瘤中PTCL-U 20例、NK/T細(xì)胞淋巴瘤11例、CTCL 11例、ATLL 4例。運(yùn)用PCR方法檢測(cè)到外周T細(xì)胞淋巴瘤中HTLV-1前病毒陽性8例(占17.39%)與唐秋萍等[5]對(duì)海南省無償獻(xiàn)血人群HTLV-I/II血清抗體陽性率(0%)的調(diào)查相比，說明海南省外周T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生與HTLV-1存在密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中ATLL患者的HTLV-1檢出率高達(dá)75%，進(jìn)一步證實(shí)了HTLV-1與ATLL的發(fā)病密切相關(guān)。CTCL中HTLV-1感染的發(fā)生率各家報(bào)道不一，從0～100%都有[6-9]，其相關(guān)性存在爭(zhēng)議，本實(shí)驗(yàn)中CTCL患者的HTLV-1檢出率為10%，與高紅陽等[10]報(bào)道的CTCL中HTLV-1的檢出率(10.5%)相近，說明HTLV-1感染與CTCL的發(fā)病可能存在一定關(guān)系。T/NK及PTCL-U與HTLV-1的關(guān)系國內(nèi)還未見報(bào)道，不過日本曾有研究發(fā)現(xiàn)28例PTCL-U中HTLV-1陽性的6例[2]。

總之，以上研究結(jié)果表明HTLV-1除與ATLL發(fā)病密切相關(guān)外，與其他類型的T細(xì)胞淋巴瘤也存在一定關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)成功提取外周T細(xì)胞淋巴瘤石蠟包埋組織中HTLV-I的cDNA，以后我們可以充分利用病理科石蠟組織的資源搜集更多的病例，進(jìn)一步研究外周T細(xì)胞淋巴瘤各類型與HTLV-I的關(guān)系，同時(shí)，我們打算建立HTLV-1感染的動(dòng)物模型，對(duì)其具體的致病機(jī)制做進(jìn)一步研究。

(廈門大學(xué)熊君輝博士對(duì)本實(shí)驗(yàn)給予了無私的幫助，特此致謝！)

[1]Dogan A,Gaulard P,Jaffe E,et al.WHO Classification of Tumours of the Haematopoietic and Lymphoid Tissues[S].France:InternationalAgency for Research on Cancer,2008.

[2]Jun-ichi Miyagi,Takayoshi Toda,Hiroshi Uezato,et al.Detection of epstein-barr virus and human T-Cell lymphotropic virus type 1 in malignant nodal lymphoma，studied in okinawa,a subtropical Area in Japan[J].Int J Hematol,2002,75:78-84.

[3]江 煒,劉衛(wèi)平,李 雷,等.石蠟包埋組織快速DNA提取方法在診斷病理PCR分析中的應(yīng)用研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2007,38(4):709-712.

[4]宋 蓓,戴啟宇,王 輝.人類T淋巴細(xì)胞病毒及其相關(guān)疾病的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志,2009,26(8):73-75.

[5]唐秋萍,蘇慶元,韓 慧,等.海南省無償獻(xiàn)血人群HTLV-Ⅰ/Ⅱ血清抗體陽性率調(diào)查[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2007,7(11):2164.

[6]Kikuchi A,Ohata Y,Matsumoto H,et al.Anti HTLV-1 antibody positivecutaneous T-celllymphoma[J].Cancer,1997,79(2): 269-274.

[7]Ghosh SK,Abrams JT,T erunuma H,et al.Human T-cell leukemia virus type I tax/rex DNA and RNA in cutaneous T-cell lymphoma [J].Blood,1994,84(8):2663-2671.

[8]Kikuchi A,Nishikawa T,Ikeda Y,et al.Absence of human T-lymphomatropic virus type I in Japanese patient s with cutaneous T-cell lymphoma[J].Blood,1997,89(5):1529-1532.

[9]Lapis P,Freeman J,Bitter MA,et al.Absence of HTLV-1 DNA sequences in cutaneous T-cell lymphoma/mycosis fungoides[J].Acta-Morphologica Hungarica,1992,40(1-4):249-255.

[10]高紅陽,單易非,王 平,等.皮膚T細(xì)胞淋巴瘤患者的人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒I型感染[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2002,29(1): 36-38.

Primary study of HTLV-1 infection in paraffin-embeded PTCL tissues.

FAN Lin-lin1,TAN Shun1*,RAO Xiang1, ZHANG Ying-ai2,WANG Shi-hua3.
Department of Pathology1,Central Laboratory2,the Affiliated Haikou Hospital of Xiangya School of Medicine,Central South University,Haikou 570208,Hainan,CHINA;3.Department of Pathology, Hospital of Agricultural Reclamation of Sanya City,Sanya 572000,Hainan,CHINA

Objective To study the relationship between Human T cell leukemia virus type-1(HTLV-1) and peripheral T cell lymphoma(PTCL)by detecting the HTLV-1 infection in paraffin-embeded PTCL tissues.MethodsForty-six samples of PTCL were classified according to World Health Organization classification(2008). Genomic DNA extracted from PTCL was detected by PCR for previous DNA of HTLV-1.ResultsEight of the 46 samples showed positive results in the detection of HTLV-1.The detection rate of HTLV-1 was 3/20,1/12,1/10,and 3/4 for peripheral T cell lymphoma-unspecified(PTCL-U),NK/T cell lymphoma,cutaneous T-cell lymphoma(CTCL),and adult T-cell lymphoma(ATLL),respectively.ConclusionHTLV-1 infection is found in patients with PTCL.HTLV-1 may be related to other type of peripheral T cell lymphoma besidesATLL.

Peripheral T cell lymphoma;HTLV-1;Paraffin-embeded tissues

R37

A

1003—6350(2012)13—001—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.13.001

2012-02-13)

海南省自然科學(xué)基金（編號(hào)：808240）

凡琳琳（1986-），女山東省菏澤市人，醫(yī)師，碩士。

談 順。E-mail:tsc116@163.com