李向利，宋會(huì)新，張術(shù)波

（1.遷西縣人民醫(yī)院胸外科，河北 遷西 064300；2.華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000）

唐山地區(qū)食管癌與人乳頭狀瘤病毒感染及p53的相關(guān)性

李向利1，宋會(huì)新1，張術(shù)波2

（1.遷西縣人民醫(yī)院胸外科，河北 遷西 064300；2.華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000）

目的 研究人乳頭狀瘤病毒(HPV)在唐山地區(qū)食管癌、癌旁組織和正常食管組織中的感染情況和p53表達(dá)的關(guān)系。方法采用TCT法檢測(cè)45例食管癌組織、相應(yīng)癌旁組織和正常食管組織中HPV感染情況，免疫組化SP法檢測(cè)p53的表達(dá)。結(jié)果45例食管癌組織、相應(yīng)癌旁組織和正常食管組織中HPV感染陽(yáng)性率分別為20.0%、40.0%和6.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，p53蛋白的檢出率分別為97.8%、62.2%和4.4%。HPV和p53陽(yáng)性表達(dá)與年齡、性別、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯聯(lián)系。HPV感染率與p53陽(yáng)性表達(dá)程度呈正相關(guān)。結(jié)論唐山地區(qū)食管癌組織中存在HPV感染，與食管癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，與p53的表達(dá)有一定的相關(guān)性。

食管癌；唐山；人乳頭狀瘤病毒；p53

食管癌是嚴(yán)重威脅人民生命的腫瘤之一，目前病因仍未明確，可能與生活習(xí)慣、遺傳因素、自然地理環(huán)境和病毒感染等有關(guān)。食管癌組織中可檢測(cè)到人乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus，HPVs)，作為第一個(gè)被確定為致腫瘤的病毒，HPV與食管癌的關(guān)系目前結(jié)論不一，不同地區(qū)HPV感染率也不等。p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，同樣也是腫瘤領(lǐng)域研究最廣泛的抑癌基因之一[1-2]。為探討HPV感染及p53的表達(dá)與食管癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本文通過(guò)采用新柏式液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)(TCT）和免疫組化檢測(cè)唐山地區(qū)食管癌患者食管癌組織HPV的感染和p53的表達(dá)情況，探討HPV感染在食管癌中和癌旁正常組織中的差異及其與p53表達(dá)的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院胸外科2005年5月至2010年11月收治的45例唐山地區(qū)食管癌患者的食管組織標(biāo)本，有完整的臨床資料，其中男性31例，女性14例；年齡45～73歲，平均(56.7±5.8）歲。食管癌組患者按1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期25例，Ⅱ期15例，Ⅲ期5例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。所有病例分別取癌組織、癌旁組織(距癌灶5 cm內(nèi))及正常食管黏膜組織制成標(biāo)本，均經(jīng)術(shù)前快速冷凍病理和術(shù)后常規(guī)病理檢查確診，術(shù)前均行化療、放療及免疫治療。

1.2 方法

1.2.1 HPV的檢測(cè) 新柏氏TCT檢查：將標(biāo)本采集在干凈、干燥的容器中，裝入離心管中離心3 min，棄上清液，將細(xì)胞保存液加入離心管中混勻倒入保存瓶，震蕩混勻，經(jīng)Thinprep 2000微電腦處理系統(tǒng)程序化處理，制成直徑2 cm的薄層細(xì)胞涂片，95%乙醇固定10 min，HE染色，封固，鏡檢。對(duì)于有多量血液黏液標(biāo)本，加入25%冰醋酸3～5滴充分混勻，經(jīng)過(guò)多次梯度程序而清除雜質(zhì)離心收集細(xì)胞，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色試劑與方法 鼠抗人p53單克隆抗體及免疫組織化學(xué)染色超敏試劑盒為美國(guó)Maxim Bistech公司產(chǎn)品。常規(guī)制片4μm厚石蠟切片，進(jìn)行p53免疫組織化學(xué)染色(SP法)，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用檸檬酸緩沖液行微波抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為空白對(duì)照，已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 均按試劑盒說(shuō)明術(shù)進(jìn)行，細(xì)胞核內(nèi)棕褐色顆粒為雜交陽(yáng)性信號(hào)。光鏡下，p53于細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，呈棕褐色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性。在高倍鏡下(×400)每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。(-)為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；(+)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例＜25%；(++)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例25%～50%；(+++)為陽(yáng)性細(xì)胞≥50%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV的感染和p53的表達(dá) 食管癌組織中HPV陽(yáng)性9例(20.0%)，癌旁組織中HPV陽(yáng)性18例(40.0%)，正常組織中HPV陽(yáng)性3例(6.7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。食管癌組織中p53陽(yáng)性44例(97.8%)，癌旁組織中p53陽(yáng)性28例(62.2%)，正常組織中p53陽(yáng)性2例(4.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 食管癌組織、癌旁組織和正常組織中HPV的感染和p53的表達(dá)情況(例)

2.2 HPV的感染和p53的表達(dá)與食管癌臨床特征的關(guān)系 本組研究中食管癌患者年齡＜55歲病例為20例，HPV表達(dá)陽(yáng)性率為20%(4/20)；≥55歲病例為25例，HPV表達(dá)陽(yáng)性率為20%(5/25)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。＜55歲病例中，p53表達(dá)陽(yáng)性率為100%(20/20)；≥55歲病例為24例，p53表達(dá)陽(yáng)性率為96%(24/25)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。食管癌男性病例數(shù)為31例，HPV表達(dá)陽(yáng)性率為22.6%(7/31)，女性病例數(shù)為14例，HPV表達(dá)陽(yáng)性率為14.3%(2/14)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。男性病例中，p53表達(dá)陽(yáng)性率為96.8%(30/31)；女性病例中，p53表達(dá)陽(yáng)性率為100%(14/14)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。據(jù)TNM分期：Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期HPV陽(yáng)性率均為20%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；Ⅰ期p53表達(dá)陽(yáng)性率為96%(24/25)，Ⅱ期和Ⅲ期HPV的p53表達(dá)陽(yáng)性率均為100%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HPV表達(dá)陽(yáng)性率為18.8%(3/16)；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例為29例，HPV表達(dá)陽(yáng)性率為20.7%(6/29)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。p53的表達(dá)在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例為16例，p53表達(dá)陽(yáng)性率為100%(16/16)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性病例為28例，HPV表達(dá)陽(yáng)性率為96.6%(28/29)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 HPV的感染和p53的表達(dá)與食管癌臨床特征的關(guān)系

2.3 食管癌中HPV感染與p53表達(dá)之間的關(guān)系 運(yùn)用Spearman相關(guān)分析食管癌中HPV感染與p53表達(dá)，HPV感染率與p53陽(yáng)性表達(dá)程度呈正相關(guān)(r=0.371，P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 食管癌中HPV感染與p53表達(dá)之間的關(guān)系

3 討論

食管癌的發(fā)生表現(xiàn)為多階段、多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，常常發(fā)現(xiàn)時(shí)已到了中晚期，預(yù)后不理想。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是目前對(duì)付癌癥的有效手段，近年來(lái)的研究致力于研究其致病機(jī)理，發(fā)現(xiàn)各種原因造成的細(xì)胞增殖與凋亡作用機(jī)制的失衡是腫瘤發(fā)生的主要原因[3]。p53基因作為目前研究較成熟的一種抑癌基因，其主要作用是當(dāng)細(xì)胞DNA發(fā)生損傷時(shí)，它能使細(xì)胞分裂終止在G1/S期，從而進(jìn)行充分的修復(fù)，當(dāng)修復(fù)成功后自動(dòng)回復(fù)正常狀態(tài)。若損傷難以修復(fù)，則進(jìn)入細(xì)胞自動(dòng)凋亡引起程序性死亡。p53基因有野生型和突變型兩種，野生型在細(xì)胞內(nèi)的活性是被嚴(yán)格控制的，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，維持正常生理代謝。突變型蛋白半衰期延長(zhǎng)，易累積，但卻已不是抑癌基因而向癌基因轉(zhuǎn)變。p53基因的失活和蛋白的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失去抑制作用或促進(jìn)細(xì)胞的惡變及過(guò)度增殖[4]。作為致癌因素之一的HPV感染，其屬于乳頭狀瘤病毒組，分型很多，根據(jù)體外研究認(rèn)為其編碼的E6蛋白能與p53蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，使其失去抑癌作用，促使細(xì)胞的增殖，故HPV感染可能是其發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一[5]。

本研究顯示食管癌、癌旁組織和正常組織中HPV陽(yáng)性率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。食管癌、癌旁組織和正常組織中p53陽(yáng)性表達(dá)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與相關(guān)研究結(jié)果相似，檢測(cè)食管癌患者中有20%發(fā)現(xiàn)HPV感染，提示HPV感染可能和唐山地區(qū)食管癌的發(fā)生存在聯(lián)系，癌旁組織中HPV感染率更是高達(dá)40%，認(rèn)為其高表達(dá)可促進(jìn)正常細(xì)胞的惡變和食管癌細(xì)胞的增殖浸潤(rùn)，考慮野生型p53蛋白半衰期短，具不穩(wěn)定性，不易檢測(cè)，突變型p53蛋白其具有癌基因活性，可引起細(xì)胞惡性增殖且具有抗凋亡作用，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生，使檢測(cè)成為可能，發(fā)生腫瘤時(shí)p53蛋白的大量表達(dá)均為突變型p53蛋白，其不再具有抑癌作用，而是促進(jìn)細(xì)胞增殖[6-7]。我們發(fā)現(xiàn)HPV感染率和p53陽(yáng)性表達(dá)與年齡、性別、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯聯(lián)系。相關(guān)研究認(rèn)為p53表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，其表達(dá)增加預(yù)示預(yù)后欠佳，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性大，與本實(shí)驗(yàn)不符，考慮本實(shí)驗(yàn)p53表達(dá)陽(yáng)性結(jié)果高，陰性例數(shù)極少，未能有效的體現(xiàn)與臨床特征間的差異，可增加樣本量再行分析。本實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為HPV感染率與p53陽(yáng)性表達(dá)程度呈正相關(guān)，與其他相關(guān)研究結(jié)果相似，認(rèn)為HPV感染可破壞細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，促使p53表達(dá)的增加，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞惡變?cè)鲋?。但仍有研究認(rèn)為HPV感染與不同地區(qū)、甚至在同一地區(qū)不同地方感染人群所占的百分比不盡相同，與食管癌的關(guān)聯(lián)性仍不好確定，有待于在今后的研究中進(jìn)一步深入及完善[8]。

綜上所述，聯(lián)合檢測(cè)二者在食管癌中的表達(dá)情況對(duì)預(yù)測(cè)食管癌的生物學(xué)行為、指導(dǎo)臨床治療有一定意義，兩者可能成為研究食管癌發(fā)病機(jī)制的有效途徑。

[1]黃偉鵬,許建生,陳潔容,等.胸段食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分布特征的螺旋CT表現(xiàn)[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)影像雜志,2009,20(4):236-239.

[2]呂宗舜,黃象謙.食管癌的診斷進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2010, 8(9):1017-1019.

[3]王東旭,李 偉.食管癌病因?qū)W進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2010, 8(9):1029-1030.

[4]漆楚波,朱潤(rùn)慶,夏和順,等.組織芯片簡(jiǎn)易制作方法及免疫組化有效性分析[J].腫瘤防治研究,2007,34(8):629-632.

[5]陳云昭,姚恩生,楊 蘭.人乳頭狀瘤病毒感染與新疆哈薩克族食管癌發(fā)生關(guān)系的探討[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2008,35(13):2407-2409．

[6]何保呂,段廣才,蔡 琳.高危型HPV感染和p53基因多態(tài)性與食管癌關(guān)系的研究[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2007,13(3):8-10．

[7]韓建英,徐致祥,邢海平,等.中國(guó)食管癌高發(fā)區(qū)與河流的相關(guān)研究[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2008,19(1):1-3．

[8]陳云昭,姚恩生,楊 蘭,等.人乳頭狀瘤病毒感染與新疆哈薩克族食管癌發(fā)生關(guān)系的探討[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2008,35(13): 2407-2409．

R735.1

B

1003—6350（2012）20—035—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.20.014

2012-05-23）

河北省唐山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：111302060b）

李向利（1976—），男，河北省遷西縣人，主治醫(yī)師，學(xué)士。