張 茹，王立生*，王建堯，姚 君，魏 鋮，師瑞月

(1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020；2.深圳市兒童醫(yī)院，廣東 深圳 518020)

·實(shí)驗(yàn)研究·

抗小鼠TLR2胞外段單表位抗體TSP-2對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎外周血和腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞表達(dá)的影響

張 茹1，王立生1*，王建堯2，姚 君1，魏 鋮1，師瑞月1

(1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020；2.深圳市兒童醫(yī)院，廣東 深圳 518020)

目的 觀察抗小鼠Toll樣受體2(Toll-like receptor 2)胞外段(mTLR2ECD)單表位抗體TSP-2對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠外周血和腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)的影響。方法采用硫酸葡聚糖鈉(C6H7Na3O14S3，DSS)制備潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型(UC模型)，將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成四組：正常對(duì)照(NC)組、模型(MD)組、TSP-2治療組和兔IgG治療組。除NC組外，其他實(shí)驗(yàn)組均給予5%DSS造模7 d后停用造模藥，藥物治療組給予后續(xù)干預(yù)治療7 d。記錄分析疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)，14 d后處死小鼠，取結(jié)腸組織行HE染色；流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血和腸系膜淋巴細(xì)胞中表達(dá)CD4+CD25+Foxp3+的Treg細(xì)胞的百分比率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果TSP-2治療組小鼠第9～14天DAI明顯低于MD組(P＜0.05)；MD組外周血和腸系膜淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率明顯低于NC組(P＜0.05)；TSP-2治療組外周血和腸系膜淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率明顯高于MD組(P＜0.05)；兔IgG治療組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論TSP-2可以提高CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)量，調(diào)節(jié)機(jī)體和腸道免疫功能，對(duì)UC發(fā)揮治療作用。

抗小鼠TLR2；胞外段；單表位抗體TSP-2；潰瘍性結(jié)腸炎

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種累及機(jī)體結(jié)腸和直腸的非特異性慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病，病因尚未明確，研究認(rèn)為本病與遺傳、感染、免疫、環(huán)境以及腸道微生態(tài)失衡等多因素以及相互作用均有重要的關(guān)系[1]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)是能抑制其他免疫細(xì)胞活化、增殖的一群細(xì)胞，在維持自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、防止自身免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要的保護(hù)作用?？剐∈骉LR2胞外段單表位抗體TSP-2具有多種生物學(xué)活性：抗炎，抗過敏，調(diào)節(jié)免疫等作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)擬研究抗小鼠TLR2胞外段單表位抗體TSP-2對(duì)UC的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠40只，體重22～26 g，6～8周齡(由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK粵2006-0015)，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房?？贵wTSP-2購于英駿生物技術(shù)公司，正常兔IgG購于鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司(由南方醫(yī)科大學(xué)楊翠蘭教授饋贈(zèng))。

1.2 試劑 葡聚糖硫酸鈉(DSS，分子量5000)購于廣州齊云生物科技有限公司。核蛋白抽提試劑盒購自Fermantas公司。1640淋巴細(xì)胞分離液購于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，膠原酶Ⅲ購于廣州斯佳公司，小鼠調(diào)節(jié)T細(xì)胞流式染色試劑盒購于eBioscience。

1.3 方法

1.3.1 模型制備與藥物治療 將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成四組，每組10只：正常對(duì)照(NC)組、模型(MD)組、TSP-2治療組(2.5 mg/kg)和兔IgG治療組(2.5 mg/kg)。NC組小鼠飲用蒸餾水14 d，其余三組飲用5%DSS的蒸餾水7 d制備UC模型，然后飲用水換為無5%DSS的蒸餾水再連續(xù)7 d，共14 d。造模7 d后，NC組和MD組腹腔注射生理鹽水，TSP-2治療組和兔IgG治療組分別按上述劑量每日注射TSP-2和兔IgG 1次。14 d后小鼠全部處死，取距肛門1 cm上的結(jié)腸組織行檢測(cè)。

1.3.2 小鼠結(jié)腸炎疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)估(DAI) 記錄小鼠每日DIA，參照Murthy評(píng)分系統(tǒng)[4]，見表1。

表1 小鼠結(jié)腸炎疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)估(DAI)

1.3.3 小鼠結(jié)腸炎組織病理學(xué)評(píng)估 取結(jié)腸組織，立即投入10%甲醛溶液中，避光固定24 h，行組織脫水、透明及包埋等，切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察。

1.3.4 流式細(xì)胞法檢測(cè) 將小鼠摘眼球取血400 μl，經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，與同體積RPMI-1640充分混合均勻，使用淋巴細(xì)胞分離液分離出全血淋巴細(xì)胞。分離并取出腸系膜淋巴結(jié)，用手術(shù)刀小心切成小塊，放入0.1%膠原酶Ⅲ中，37℃，孵育20 min，過200目尼龍網(wǎng)充分研磨，使用淋巴細(xì)胞分離液分離出腸系膜淋巴細(xì)胞。將上述兩步所得的淋巴細(xì)胞，分別溶于1×流式染色緩沖液中，淋巴細(xì)胞數(shù)調(diào)至1×106/管，按照流式試劑盒操作步驟，標(biāo)記CD4+和CD25+單克隆抗體后，加入固定/破膜反應(yīng)液在4℃，孵育，避光12 h后，細(xì)胞核內(nèi)抗小鼠Foxp3+抗體染色，使用抗IgG2a作為同型陰性對(duì)照管，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間的差異采用單因素方差分析，設(shè)定P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠DAI評(píng)估 正常組小鼠DAI評(píng)分為0；MD組和兔IgG治療組均在第5天到第14天出現(xiàn)明顯的糊狀便或液態(tài)血便、體重減輕，兩組DAI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；TSP-2治療組從第10天開始未再出現(xiàn)肉眼血便、糞便能成形且體重減輕較少，與MD組和兔IgG治療組比較，TSP-2治療組在第10～14天DAI降低明顯(P＜0.05)，見圖1。

圖1 疾病活動(dòng)指數(shù)

2.2 小鼠結(jié)腸病理學(xué)評(píng)估 與NC組相比較，MD組和兔IgG治療組均表現(xiàn)為腸道的急性炎癥期，伴有黏膜的水腫、糜爛、隱窩明顯減少、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)黏膜層和固有層。TSP-2治療組可見腸道黏膜被侵蝕及腺上皮消失等炎癥反應(yīng)明顯低于MD組。

圖2 小鼠結(jié)腸病理(病理切片×200倍)

2.3 抗體TSP-2對(duì)UC小鼠外周血與腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率的影響 與NC組比較，MD組小鼠外周血與腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率顯著降低(P＜0.05)；但是TSP-2治療組小鼠外周血與腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+/ CD4+百分率顯著升高(P＜0.05)；MD組與兔IgG治療組的小鼠外周血與腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表4 抗體TSP-2對(duì)UC小鼠外周血與腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率的影響?

表4 抗體TSP-2對(duì)UC小鼠外周血與腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率的影響?

注：與NC組比較，*P＜0.05；與MD組比較，#P＜0.05。

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3 討論

UC是一種病因不明的直腸和結(jié)腸慢性炎癥疾病，腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Treg功能異?；驍?shù)量減少均可發(fā)生與免疫相關(guān)的UC[5]。正常狀態(tài)的CD4+CD25+Treg對(duì)UC的活動(dòng)期有明顯的控制作用。Foxp3是核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，證實(shí)只有Foxp3表達(dá)的腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Treg才能發(fā)揮對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用；此外Foxp3對(duì)腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Treg表達(dá)、成熟及功能發(fā)揮都起到了關(guān)鍵的促進(jìn)作用[6]，而Foxp3的缺乏可誘發(fā)自身免疫疾病[7-8]。Toll樣受體(Toll-like receptors)是機(jī)體抵抗感染性疾病的第一道屏障，在UC中的免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，識(shí)別侵入體內(nèi)的微生物進(jìn)而激活免疫細(xì)胞應(yīng)答[9]。Toll樣受體具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，在機(jī)體抗感染的免疫反應(yīng)過程中著非常重要作用。TLR2是細(xì)菌共有抗原成分的“模式”識(shí)別受體，在機(jī)體免疫的發(fā)生、發(fā)展中居于核心地位[10]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，在DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型中，通過組織病理切片和每日的DAI評(píng)分觀察，證實(shí)UC小鼠腸道為急性炎癥期，可見腸黏膜有水腫、糜爛、隱窩減少以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)黏膜層和固有層。同時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示外周血與腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率明顯降低，腸道免疫狀態(tài)失衡，處于明顯的炎癥反應(yīng)期，此外，全血中的Foxp3+表達(dá)的Treg細(xì)胞總數(shù)減少，顯示機(jī)體的免疫功能處于相對(duì)抑制狀態(tài)。因此，腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3 Treg與UC的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后都密切相關(guān)。本研究通過給予UC小鼠抗小鼠TLR2胞外段單表位抗體TSP-2干預(yù)治療后，證實(shí)腸黏膜炎癥明顯緩解，糜爛、水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等較MD組明顯減輕；同時(shí)，小鼠外周血和腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+/ CD4+百分率明顯升高，但是，正常兔IgG治療組與MD組對(duì)照無明顯變化。實(shí)驗(yàn)顯示TSP-2對(duì)UC小鼠有良好的治療作用，考慮有以下原因：(1)抗小鼠TLR2胞外段單表位抗體TSP-2可以提高腸道黏膜內(nèi)的Foxp3+的表達(dá)，使有效的Treg細(xì)胞功能上得以恢復(fù)，使CD4+CD25-Treg向CD4+CD25+Treg轉(zhuǎn)化增多，平衡了腸道免疫系統(tǒng)從而使腸道的炎癥反應(yīng)得到相應(yīng)的控制和腸黏膜的修復(fù)。(2)全血中的CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率明顯升高也進(jìn)一步證實(shí)，腸道局部免疫功能的恢復(fù)，對(duì)整個(gè)機(jī)體來說形成了一個(gè)良性循環(huán)和反饋?zhàn)饔?，使宿主的全身免疫系統(tǒng)得到了相應(yīng)的調(diào)節(jié)，利于病情的恢復(fù)和控制。(3)抗小鼠TLR2胞外段單表位抗體TSP-2可能發(fā)揮了其自身的抗感染作用，部分阻斷了病原微生物在腸道中的不良作用，對(duì)腸道微生態(tài)菌群起到了明顯的調(diào)節(jié)作用，致病菌減少，而益生菌相對(duì)增多。(4)TSP-2的抗感染拮抗作用，可能部分緩解腸道內(nèi)皮細(xì)胞腫脹及通透性的增加。

總之，TSP-2能夠提高外周血與腸系膜淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率，從而提高了Foxp3+的表達(dá),可以調(diào)節(jié)腸道過度的免疫反應(yīng)和抗炎作用,對(duì)UC發(fā)揮了一定的治療效果。因此，TSP-2作為Toll樣受體的特異性抗體，提高了它在UC治療中的應(yīng)用價(jià)值。

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R-332

B

1003—6350（2012）20—015—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.20.006

2012-03-21)

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：10151802001000002)、深圳市重點(diǎn)基金項(xiàng)目(編號(hào)：200901003)

張 茹(1981—)，女，廣東省深圳市人，主治醫(yī)師，碩士。

*通訊作者：王立生，博士生導(dǎo)師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病診斷與治療。E-mail:wangls168@163.com