王金東，劉壽桃，林煥彩，郝高峰，喬永剛

(1.深圳市婦幼保健院口腔疾病防治中心，廣東 深圳 518048；2.中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院口腔預(yù)防科中山大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510055)

穩(wěn)定存在于唾液中的蛋白質(zhì)達(dá)90多種，唾液蛋白可通過多種途徑影響齲病的發(fā)生發(fā)展，其含量和組成可隨年齡、機(jī)體的健康狀況而發(fā)生改變[1]。過往調(diào)查表明我國兒童乳牙齲患病率高且存在兩極分化傾向，兒童患齲程度存在明顯差異[2]，但目前尚缺乏基于流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)的不同患齲狀況兒童與唾液蛋白中關(guān)鍵組份的定量研究報道。本研究定量分析了不同患齲程度兒童唾液中總蛋白和部分唾液蛋白組份的含量，以期探討它們之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以本課題組2005年廣州從化市兒童齲病流行病學(xué)調(diào)查所得數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，采用單純隨機(jī)抽樣法選取4～5歲兒童80名，分為無齲組(Caries free group，dmft=0)40人，高齲組(Caries susceptible group，dmft≥5)40人，每組男女各半(齲病診斷按世界衛(wèi)生組織1997年推薦的《口腔健康調(diào)查基本方法》第四版中的標(biāo)準(zhǔn))。所有兒童及家長均知情并同意參加該項研究。排除有全身疾患者。

1.2 方法

1.2.1 總蛋白含量測定 上午9：00～11：00，采用吐取法收集受激全唾液約3 ml(混有血跡者棄之)，將唾液樣本收集至無菌離心管，冰存4 h內(nèi)送回實驗室。4℃離心(10 000 r/min，60 mm)15 min，取上清-80℃保存?zhèn)溆?。利用雙金雞納酸的雙縮脲反應(yīng)，采用分光光度法測定，使用Tecan Sunrise酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)。

1.2.2 唾液蛋白電泳分析 采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳法(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)對 唾液樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。分離條件：濃縮膠120 V，100 mA；分離膠180 V，100 mA?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色，Ultra-lum Omega多功能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描，1D Scan Ex專業(yè)凝膠圖像分析軟件測定目標(biāo)條帶。采用寬分子量蛋白質(zhì)marker(美國Sigma)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗，設(shè)α=0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同齲易感兒童唾液總蛋白含量 男、女合計唾液中總蛋白含量均為高齲組低于無齲組(P＜0.05)，不同性別兒童總蛋白含量兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.518)。

2.2 SDS-PAGE電泳分析結(jié)果 經(jīng)15%SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，10 000、28 000、38 000、56 000和77 000蛋白百分含量高齲組均高于無齲組(P＜0.05)，14 500蛋白百分含量兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1，圖1)。

表1 兩組兒童唾液各蛋白組分百分含量比較(IA/μg，±s)

表1 兩組兒童唾液各蛋白組分百分含量比較(IA/μg，±s)

組別高齲組無齲組t值P值例數(shù)40 40--10 000蛋白29.22±11.46 23.19±11.77 2.324 0.023 14 500蛋白8.96±4.28 7.48±4.55 1.501 0.137 28 000蛋白19.17±11.84 13.00±6.19 2.924 0.005 38 000蛋白23.95±9.00 18.66±7.69 2.824 0.006 56 000蛋白87.10±39.21 61.76±26.24 3.398 0.001 77 000蛋白12.50±7.73 8.71±4.28 2.711 0.009

圖1 唾液蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)高齲兒童唾液中總蛋白含量低于無齲兒童，不同性別兒童之間唾液中總蛋白含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對4～5歲不同齲易感兒童刺激性全唾液總蛋白含量的研究鮮見報道，本研究結(jié)果與Tulunoglu等[3]對7～10歲兒童的研究一致。唾液中總蛋白含量隨年齡呈明顯的上升趨勢[4]。其與齲病的具體相關(guān)關(guān)系應(yīng)深入研究。

本研究中唾液蛋白SDS-PAGE凝膠電泳可分離出7～14條可分析條帶，平均每個樣品可分離出10條，其中10 000、14 500、28 000、38 000、56 000、77 000位置的6種不同分子量蛋白條帶穩(wěn)定出現(xiàn)。高齲組與無齲組比較條帶數(shù)目較為相似，Banderas-Tarabay等[5]和Shiba等[6]的研究結(jié)果與本研究相似。Schwartz等[7]對成人全唾液蛋白用SDS-PAGE分離出了34條條帶，本研究分離的蛋白條帶數(shù)目與之相比較少，可能與以下原因有關(guān)：1)目標(biāo)人群不同，種族和年齡不同均可能導(dǎo)致唾液蛋白組成發(fā)生質(zhì)和(或)量的變化；2)電泳條件不同，本研究選用Mini型垂直電泳系統(tǒng)，凝膠厚度0.75 mm；3)條帶分析標(biāo)準(zhǔn)不同，本研究只統(tǒng)計用1D Scan Ex凝膠圖像分析軟件可以分析的掃描條帶，而有的學(xué)者是視覺觀察與軟件分析相結(jié)合，觀察到的條帶均計算在內(nèi)。

研究結(jié)果顯示，刺激性全唾液中10 000、28 000、38 000、56 000、77 000蛋白的百分含量均為高齲組高于無齲組；14 500蛋白的百分含量兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

相對分子量為10 000的唾液蛋白是堿性富脯蛋白，28 000位置的為酸性富脯蛋白，56 000位置則有相當(dāng)一部分為糖基化富脯蛋白。富脯蛋白可達(dá)受激唾液蛋白總量的10%，根據(jù)其糖基化程度分為堿性富脯蛋白、酸性富脯蛋白、糖基化富脯蛋白等[8]。本研究結(jié)果顯示10 000和28 000蛋白的百分含量高齲組均高于無齲組。胡云明等[9]用高效疏水液相色譜法對不同齲易感人群腮腺唾液蛋白檢測亦得出相同結(jié)果。Ayad等[10]利用高效液相色譜法對高齲組和無齲組成人腮腺液中的富脯蛋白進(jìn)行了分離分析，未發(fā)現(xiàn)兩組間有差異。與本研究的結(jié)果不符，具體原因有待進(jìn)一步的研究。

唾液中相對分子量為38 000的蛋白是SIgA，本研究結(jié)果顯示高齲組SIgA百分含量高于無齲組，提示致齲菌處于活躍狀態(tài)時，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，致SIgA分泌增多，從而增強(qiáng)對牙體組織的保護(hù)作用，抑制齲病的發(fā)展。吳曉霞等[11]用非競爭性生物素-抗生物素酶聯(lián)免疫吸附法對4～5歲兒童非刺激性全唾液中SIgA濃度與齲病關(guān)系進(jìn)行分析，認(rèn)為高齲兒童SIgA百分含量低于無齲組。本研究結(jié)果與吳曉霞等[11]的研究不符，可能與檢測方法、樣本量大小、樣品處理方式等因素有關(guān)。

相對分子量為56 000位置的是唾液α-淀粉酶及其同功酶和糖基化富脯蛋白的混合蛋白，其中主要是唾液α-淀粉酶及其同功酶。在根面齲的研究中發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶可以抑制牙體組織的脫礦[12]。景娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)20～30歲的高齲人群α-淀粉酶百分含量高于無齲組，本研究結(jié)果與之一致。

本研究認(rèn)為14 500蛋白百分含量兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。溶菌酶分子量為14 500，是宿主口腔先天性防御系統(tǒng)的關(guān)鍵組份。本研究結(jié)果與Stuchell等[7]采用免疫擴(kuò)散法對成人檢測的結(jié)果一致。Bai等[14]對42～54個月幼兒的研究則發(fā)現(xiàn)高齲兒童唾液溶菌酶的含量比無齲兒童高。出現(xiàn)不同的結(jié)果可能與測定方法有別相關(guān)，本研究采用SDS-PAGE凝膠電泳，Bai等[14]利用比濁法進(jìn)行檢測。雖然在體內(nèi)和體外實驗中均表明溶菌酶可以明顯地抑制致齲菌的生長，但是唾液中溶菌酶含量與不同齲易感性的關(guān)系尚不明確。

高齲兒童刺激性全唾液中77 000蛋白的百分含量高于無齲組。唾液中乳鐵蛋白的分子量為77 000，乳鐵蛋白通過與鐵形成螯合物奪取細(xì)菌生長必需的鐵離子而抑制細(xì)菌生長，亦能直接殺滅部分細(xì)菌。本研究結(jié)果與Sikorska等[15]多位學(xué)者的研究相符，其對15歲組人群研究發(fā)現(xiàn)，齲易感性與唾液中乳鐵蛋白含量高度相關(guān)，齲面值越高，乳鐵蛋白百分含量也越高[15]。粘附能力強(qiáng)的細(xì)菌可刺激唾液中乳鐵蛋白的分泌，乳鐵蛋白含量的增加又可協(xié)同唾液中其他蛋白抑制細(xì)菌的致齲作用。符合機(jī)體的生理性應(yīng)激機(jī)制，提示乳鐵蛋白在乳牙齲病發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。

乳牙齲的危害十分嚴(yán)重，唾液蛋白中關(guān)鍵組分在乳牙齲病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。今后應(yīng)著重研究各蛋白組分在齲病發(fā)生發(fā)展中所起的具體作用，以期明確它們與乳牙齲的關(guān)系。

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