高 琴,胡俊鋒,于 影,姜翠榮,關(guān)宿東,李正紅△

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,安徽蚌埠 233030;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,安徽 蚌埠 233004)

近年來,一定濃度的乙醇可發(fā)揮心肌保護(hù)作用已越來越得到共識(shí)。臨床數(shù)據(jù)顯示,適度飲酒可降低心肌梗死的發(fā)生和心肌梗死患者的致死率,減少中風(fēng)的發(fā)生[1]。乙醇心肌保護(hù)作用機(jī)制涉及腺苷受體、腎上腺素受體和蛋白激酶C系統(tǒng)的激活、線粒體ATP敏感性鉀通道的開放、熱休克蛋白的表達(dá)、激活JNK-1、c-Jun等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮抗凋亡作用、促進(jìn)乙醛脫氫酶2的生成等[2～4]。一氧化氮(nitric ox-ide,NO)是機(jī)體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,乙醇的保護(hù)作用是否與改變心肌組織NO的釋放有關(guān)報(bào)道甚少。本研究擬在乙醇后處理心肌保護(hù)作用的基礎(chǔ)上,研究其是否通過改變心肌組織NO發(fā)揮作用,進(jìn)一步分析其與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥品

健康雄性SD大鼠體重200～250 g,清潔級(jí),由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

左旋-硝基精氨酸甲基酯(L-nitro-argininemethylester,L-NAME),蒼術(shù)苷(atractyloside,Atr),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5 triphenyl-tetrazolium chloride,TTC),伊文思蘭(Evans blue)為Sigma公司產(chǎn)品。99.7%乙醇(ethanol,EtOH)購自安徽省蚌埠市新科電化試劑廠。NO試劑盒購自南京建成生物制品有限公司。Bcl-2、Bax和β-actin引物均由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下Bcl-2上游引物為5'-CTG GTG GAC AAC ATC GCT CTG-3',下游引物為5'-GGT CTG CTG ACC TCA CTT GTG-3',產(chǎn)物長(zhǎng)度228 bp;Bax上游引物為5'-GGA TCG AGC AGA GAG GAT GG-3',下游引物為5'-TGG TGA GTG AGG CAG TGA GG-3',產(chǎn)物長(zhǎng)度 464 bp;β-actin 上游引物為5'-GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAAGGA C-3',下游引物為5'-GCT CAT TGC CGA TAG TGA TGA CT-3',產(chǎn)物長(zhǎng)度630 bp。改良Krebs-Henseleit(K-H)液成分(mmol/L):NaCl 118.0,KCl 4.7,K2PO41.2,MgSO41.2,NaHCO325.0,CaCl21.25,葡萄糖11.0,pH 7.3～7.4。

1.2 大鼠離體心臟灌流

雄性SD大鼠斷頭后開胸,迅速取出心臟,置于4℃改良K-H液中沖洗,固定于Langendorff灌流裝置,K-H液常規(guī)恒壓(76 mmHg)灌流,pH 7.3～7.4,以95%O2+5%CO2飽和,維持灌流液溫度37℃。將充水乳膠囊由切開的左心耳處插入至左心室,囊內(nèi)壓力經(jīng)特氟綸管傳遞至壓力傳感器,MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄血流動(dòng)力學(xué)變化。

1.3 左心室功能評(píng)價(jià)

向插入左心室內(nèi)的乳膠囊注水使左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)維持于4～8 mmHg,連續(xù)記錄左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure,LVDP)、心率(heart rate,HR)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure,±dP/dtmax)和LVEDP等各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 灌流心臟流出液乳酸脫氫酶的測(cè)定

在心肌復(fù)灌5 min和10 min收集冠脈流出液,分光光度法測(cè)定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量。

1.5 心肌梗死面積測(cè)定

離體心臟復(fù)灌結(jié)束后再結(jié)扎冠脈,取1%伊文思蘭經(jīng)主動(dòng)脈注入心臟,冷凍后與心臟縱軸垂直切成2 mm均勻薄片,1%TTC染色10～15 min,10%福爾馬林固定,區(qū)分各區(qū)域。藍(lán)色為非梗死區(qū),紅色為危險(xiǎn)區(qū),蒼白色為梗死區(qū)。掃描儀掃描染色的心臟切片。使用Image/J軟件測(cè)量相關(guān)區(qū)域面積,計(jì)算梗死區(qū)占危險(xiǎn)區(qū)的比值。

1.6 心肌組織NO的測(cè)定

取左心室心尖部組織100 mg,勻漿后離心,取上清液,采用硝酸還原比色法測(cè)定心肌組織中NO含量。

1.7 RT-PCR方法檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)

提取心尖部組織總RNA,用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min后,以(1)95℃50 s變性;(2)Bcl-2退火溫度57.6℃45 s,Bax退火溫度 62.2℃45 s,β-actin退火溫度55.5℃45 s;(3)72℃60 s,反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠顯色。GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)拍攝記錄,圖像分析軟件對(duì)泳帶進(jìn)行光密度掃描作半定量分析,以目的基因與內(nèi)參對(duì)照的積分吸光度比值(Bcl-2/β-actin;Bax/βactin)表示mRNA相對(duì)表達(dá)量,并計(jì)算Bcl-2/Bax比值。

1.8 實(shí)驗(yàn)分組

大鼠心跳穩(wěn)定20 min后,隨機(jī)分為5組(n=8):(1)正常對(duì)照組:心肌K-H液持續(xù)灌流150 min;(2)缺血/復(fù)灌組:結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30 min模擬局部心肌缺血,隨后松開結(jié)扎線恢復(fù)灌流120 min為單純?nèi)毖?復(fù)灌(ischemia and reperfusion,I/R);(3)乙醇后處理組:結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30 min,恢復(fù)灌流120 min復(fù)制I/R,但在缺血末5 min,復(fù)灌初期10 min給予乙醇50 mmol/L,共灌流15 min[4]進(jìn)行乙醇后處理干預(yù);(4)乙醇后處理+L-NAME組:同乙醇后處理組,但在缺血末5 min復(fù)灌初期10 min同時(shí)給予一氧化氮合酶抑制劑L-NAME(100 μ mol/L)灌流15 min[5];(5)乙醇后處理+Atr組:同乙醇后處理組,但在缺血末5 min復(fù)灌初期10 min同時(shí)給予線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔道開放劑Atr(20 μ mol/L)灌流15 min[6]。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)及酶學(xué)、梗死面積改變

隨著灌流時(shí)間的延長(zhǎng),正常對(duì)照組大鼠LVDP和±dP/dtmax略有下降,LVEDP略有上升,但前后比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組相比,I/R組缺血及復(fù)灌各時(shí)間點(diǎn)LVDP和±dP/dtmax明顯下降,LVEDP顯著抬高,LDH釋放增多(P＜0.01)。與I/R相比,乙醇后處理使LVDP和±dP/dtmax明顯上升,LVEDP下降(表1),心肌梗死面積降低(P＜0.01),復(fù)灌 5 min和10 min冠脈流出液中LDH含量明顯降低(P＜0.01,表2)。與乙醇后處理組相比,一氧化氮合酶抑制劑L-NAME和線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔道開放劑Atr引起復(fù)灌期LVDP和±dP/dtmax下降,LVEDP抬高,心肌梗死面積增大,LDH釋放增多(表1,表2)。

2.2 心肌組織NO含量改變

與正常大鼠心肌相比,I/R大鼠心尖部組織NO含量明顯增加。與I/R相比,乙醇后處理使NO含量明顯降低。L-NAME和Atr與乙醇聯(lián)合用藥,均使得NO進(jìn)一步下降(表3)。

2.3 心肌組織Bcl-2和Bax變化

與正常組相比,I/R組心肌Bax mRNA表達(dá)增加,Bcl-2/Bax比值降低。與I/R組相比,乙醇后處理組Bcl-2 mRNA表達(dá)增強(qiáng),Bax mRNA表達(dá)降低,Bcl-2/Bax比值顯著增加。L-NAME和Atr與乙醇聯(lián)合用藥,均使Bcl-2 mRNA的表達(dá)降低,Bax mRNA的表達(dá)提高,Bcl-2/Bax比值降低(圖1,表4)。

3 討論

NO作為調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的主要細(xì)胞信使分子在機(jī)體生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中觀察到心肌I/R后NO含量明顯增加,Bcl-2/Bax比值降低,心肌出現(xiàn)損傷和凋亡發(fā)生;EtOH使NO在一定范圍內(nèi)降低,心功能得到改善,減弱凋亡的發(fā)生;L-NAME和Atr進(jìn)一步降低NO水平,Bcl-2/Bax比值亦降低,減弱了EtOH的心肌保護(hù)作用和抗凋亡作用,提示機(jī)體內(nèi)NO維持一定水平是保持正常生理功能的必要條件,NO濃度過高或過低都可能造成機(jī)體損傷。EtOH可能通過降低心肌I/R引起的NO過度增加發(fā)揮保護(hù)作用。

Tab.1 Hemodynamic parameters in the isolated perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion(±s,n=8)

Tab.1 Hemodynamic parameters in the isolated perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion(±s,n=8)

I/R:Ischemia/reperfusion;EtOH:Ethanol;L-NAME:L-nitro-arginine-methylester;Atr:Atractyloside**P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs I/R group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs EtOH group

Variable Baseline Ischemia 30 min Reperfusion 30 min Reperfusion 120 min LVDP(mmHg)Normal 83.52±5.82 81.44±6.23 80.61±6.65 78.95±5.91 I/R 84.24±6.78 47.22±7.22** 48.11±9.94** 36.16±5.77**EtOH 84.66±7.54 48.61±10.25 69.74±6.24## 63.16±6.13##EtOH+L-NAME 83.70±5.92 49.47±9.57 43.08±6.65△△ 39.61±6.25△△EtOH+Atr 84.26±5.51 46.20±7.03 49.80±4.68△△ 38.01±7.05△△LVEDP(mmHg)Normal 6.12±1.54 6.54±1.42 6.94±2.01 7.13±2.33 I/R 5.94±1.37 8.38±1.68** 10.44±2.59** 12.36±1.91**EtOH 5.84±1.01 7.18±3.05 7.63±1.26# 7.95±0.78##EtOH+L-NAME 6.03±1.26 8.36±0.46 12.74±2.23△△ 12.84±3.67△EtOH+Atr 5.96±1.07 8.12±1.03 11.38±2.57△ 12.91±3.04△+dp/dtmax(mmHg/s)Normal 2354.21±209.44 2322.47±202.25 2215.28±177.65 2142.21±190.41 I/R 2313.21±247.25 1566.94±198.05** 1204.53±155.27** 970.89±134.76**EtOH 2466.59±353.51 1560.63±317.11 1505.52±169.15# 1463.66±189.22##EtOH+L-NAME 2240.25±359.06 1571.42±329.95 1207.43±215.62△ 928.07±132.69△△EtOH+Atr 2242.55±418.47 1576.45±306.91 1220.73±175.19△ 947.25±130.73△△-dp/dtmax(mmHg/s)Normal 1562.07±145.78 1506.41±160.09 1478.93±152.66 1452.35±133.48 I/R 1585.48±169.96 986.79±194.1** 626.65±130.87** 562.93±117.12**EtOH 1519.66±279.89 984.58±206.16 897.90±149.12# 853.88±150.25##EtOH+L-NAME 1506.82±182.92 935.33±175.39 628.45±120.52△△ 565.24±107.28△△EtOH+Atr 1538.10±139.09 899.95±151.22 624.62±172.34△ 559.65±113.81△△

Tab.2 Infarct size and LDH release in coronary effluent of rat hearts(±s,n=8)

Tab.2 Infarct size and LDH release in coronary effluent of rat hearts(±s,n=8)

I/R:Ischemia/reperfusion;EtOH:Ethanol;L-NAME:L-nitro-arginine-methylester;Atr:Atractyloside**P＜0.01 vs normal group;## P＜0.01 vs I/R group;△△ P＜0.01 vs EtOH group

Group Infarct size(%)LDH(U/ml)at reperfusion 5 min 10 min Nor mal 0±0 19.52±3.55 20.25±3.63 I/R 49.42±4.96 65.06±5.24**72.43±4.65**EtOH 29.59±2.37##19.37±3.31##31.06±5.20##EtOH+L-NAME48.95±7.55△△ 56.50±6.18△△ 58.35±4.24△△EtOH+Atr 50.47±5.32△△ 62.56±3.83△△ 65.73±4.98△△

Tab.3 NO contents of heart tissue in rats(±s,n=8)

Tab.3 NO contents of heart tissue in rats(±s,n=8)

I/R:Ischemia/reperfusion;EtOH:Ethanol;L-NAME:L-nitro-arginine-methylester;Atr:atractyloside**P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs I/R group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs EtOH group

Group NO content(μ mol/L)Normal 38.03±2.16 I/R 80.55±2.28**EtOH 25.21±5.06**##EtOH+L-NAME 18.47±3.67##△EtOH+Atr 18.68±4.43##△△

Fig.1 Changes of Bcl-2 and Bax mR NA expressions of heart tissue in rats

Tab.4 Expressions of Bcl-2 and Bax mRNA of heart tissue in rats(±s,n=8)

Tab.4 Expressions of Bcl-2 and Bax mRNA of heart tissue in rats(±s,n=8)

I/R:Ischemia/reperfusion;EtOH:Ethanol;L-NAME:L-nitro-arginine-methylester;Atr:Atractyloside**P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs I/R group;△△P ＜0.01 vs EtOH group

Group Bcl-2/β-actin Bax/β-actin Bcl-2/Bax Normal 0.33±0.05 0.70±0.08 0.47±0.04 I/R 0.26±0.03 1.42±0.06**0.18±0.03**EtOH 0.42±0.06##0.78±0.07##0.53±0.05##EtOH+L-NAME0.31±0.03△△ 1.09±0.06△△ 0.29±0.07△△EtOH+Atr 0.24±0.02△△ 1.26±0.07△△ 0.19±0.04△△

NO生成過多引起心肌功能受損。心肌I/R時(shí)產(chǎn)生大量ROS,尤其是超氧陰離子(O2-)等“爆發(fā)式”生成。過多的NO可與O2-反應(yīng),生成具有很強(qiáng)細(xì)胞毒性的過氧亞硝酸陰離子(ONOO-),氧化細(xì)胞內(nèi)鐵/硫中心、鋅指結(jié)構(gòu)、蛋白巰基(如Na+-Ca2+交換蛋白)、脂質(zhì)等,抑制線粒體呼吸,影響ATP的產(chǎn)生,引起鈣超載,導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA的損傷及凋亡發(fā)生[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EtOH可使NO釋放明顯降低,Bcl-2/Bax比值增加,提示EtOH可能通過降低NO的生成,減少ONOO-等的過度增加發(fā)揮抗缺血復(fù)灌損傷和抗凋亡作用。

實(shí)驗(yàn)中,我們還觀察到一氧化氮合酶抑制劑LNAME和線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔道開放劑Atr減弱E-tOH保護(hù)作用的同時(shí),NO水平進(jìn)一步降低,提示NO濃度過低對(duì)機(jī)體亦不利。一定濃度的NO是維持心血管正常功能活動(dòng)的必需條件。一定劑量的NO引起冠脈擴(kuò)張,冠狀血流增加;NO可直接淬滅氧自由基、阻滯羥自由基的形成及終止脂膜上的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),維持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性;NO減少中性粒細(xì)胞的粘附,減少再灌注晚期心肌組織內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn);NO還可直接作用于線粒體ATP敏感性鉀通道等,引起其開放,減輕Ca2+超載等起到心肌保護(hù)作用[8]。L-NAME在EtOH降低NO的基礎(chǔ)上使其水平進(jìn)一步下降,可能使得NO低于了機(jī)體的正常需求,從而減弱EtOH的作用。Atr是線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔道的開放劑,其開放亦引起NO的過度降低。文獻(xiàn)報(bào)道NO可能通過下調(diào)線粒體跨膜電位、開放線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔并釋放線粒體 cytC,誘導(dǎo)SMMC-7721和HepG2細(xì)胞凋亡[9];亦有文獻(xiàn)報(bào)道NO可抑制該孔道的開放[10],進(jìn)一步提示NO和該孔道之間存在一定的聯(lián)系,兩者之間如何相互影響?其機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

因此我們推測(cè),EtOH后處理可通過降低心肌NO釋放和抑制線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔道的開放發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

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