鄭 浩，童光志

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）屬黃病毒科黃病毒屬(Flavivirus)，同屬成員還包括西尼羅河病毒(West Niles virus，WNV)、墨累谷腦炎病毒(Murray encephalitis virus，MVEV)、圣路易斯腦炎病毒(St.louis encephalitis virus，SLEV)、黃熱病毒 (Yellow fever virus，YFV)、登革病毒(Dengue virus，DENV)和蜱傳腦炎病毒(Tickborne encephalitis virus，TBEV)等。由于存在共同抗原，JEV與WNV、MVEV、SLEV構(gòu)成黃病毒中的乙型腦炎血清群[1]。黃病毒屬成員具有相同的基因組結(jié)構(gòu)，對(duì)應(yīng)基因編碼蛋白具有相近功能[2]。

JEV基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)約11 kb，僅由單一開放閱讀框翻譯。表達(dá)的多聚蛋白在翻譯中或翻譯后裂解出3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、prM、E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）[2]。在JEV感染細(xì)胞中，可發(fā)現(xiàn)一個(gè)與NS1蛋白相關(guān)，但比NS1蛋白大的蛋白，稱之為NS1'蛋白[3,4]。早期研究認(rèn)為，NS1'蛋白是NS1蛋白C端在NS2A蛋白內(nèi)裂解所形成的。Melian等[5]研究發(fā)現(xiàn)WNV可通過核糖體-1移碼機(jī)制翻譯出NS1′蛋白。本文根據(jù)病毒移碼信號(hào)分析JEV基因組序列，并鑒定NS1'蛋白移碼序列。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞 JEV HEN0701株分離自2007年河南地區(qū)流產(chǎn)豬胎兒，其基因組GenBank登錄號(hào)為FJ495189[6,7]。Vero細(xì)胞以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 抗JEV NS1單克隆抗體中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾賓獸醫(yī)研究所華榮虹博士贈(zèng)送；小量質(zhì)粒提取純化試劑盒和小量DNA片段快速回收試劑盒購(gòu)自廣東東勝生物技術(shù)公司；His-Bind Purification Kit為Merck產(chǎn)品；氟氏完全佐劑和氟氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；Top10感受態(tài)細(xì)胞和BL-21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生物技術(shù)公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和Western及IP細(xì)胞裂解液均為碧云天產(chǎn)品；LATaqDNA polymerase為大連寶生物產(chǎn)品；昆明小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；DMEM培養(yǎng)基、FCS均購(gòu)自Gibco公司。

1.3 NS1′移碼片段的原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)NS1與NS2編碼區(qū)內(nèi)移碼信號(hào)及發(fā)生移碼的編碼框序列,設(shè)計(jì)下列引物序列：PNS1F: 5'-GAagatctA GCgctGGCccGTCTggtgatgtttctggcc-3'；PNS1R: 5'-ccgctcgagTTAggatccGTGCAGGTGATGCCCCCAA GCATC-3'；PNS1HF: 5'- GAagatctcatcatcatcatcatcat AGCGCTGGCCCGTCTGGTG-3'

以PNS1F和PNS1R為引物，以HEN0701的基因組cDNA克隆為模板[7]，以LATaqDNA polymerase作PCR，擴(kuò)增獲得156 bp片段。以BglⅡ和XhoⅠ酶切回收的擴(kuò)贈(zèng)片段，以BamHⅠ和XhoⅠ酶切pET-28a載體，將酶切片段以T4 DNA 連接酶連接入pET-28a載體中。通過NdeI和XhoI酶切篩選，獲得表達(dá)NS1'移碼片段的pET1NS。以pET1NS為摸板，以PNS1F和PNS1HF為引物，PCR擴(kuò)增獲得His標(biāo)簽與NS1'移碼片段融合的片段H-NS1'。以BglⅡ和XhoⅠ酶切回收的H-NS1'，以BamHI和XhoⅠ酶切pET1NS。將酶切的H- NS1'片段以T4 DNA 連接酶連接入pET1NS載體中。通過NdeI和XhoI酶切篩選，獲得表達(dá)2倍NS1'移碼片段的pET2NS。以BamHI和XhoⅠ酶切pET2NS, 將經(jīng)BglⅡ和XhoⅠ酶切的H- NS1'連接入pET2NS中，通過NdeⅠ和XhoⅠ酶切篩選，獲得表達(dá)3倍NS1'移碼片段的pET3NS。將pET3NS以T7 terminator primer測(cè)序。

1.4NS1'移碼片段的表達(dá)與純化 將pET3NS轉(zhuǎn)化BL-21感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落，接種含卡那霉素的 LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜后，按1:100轉(zhuǎn)接新的含卡那霉素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600=0.6），加入終濃度為1.0 mmoL/L的IPTG在37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。以6000×g離心10 min收集菌體，并以500 μL PBS懸浮洗滌1次。將部分菌體冰浴條件下進(jìn)行超聲波破碎，超聲5 s，間歇5 s，超聲10 min，然后將破碎菌體于10 800×g離心5 min，收集上清和沉淀，將上清和未破碎菌體進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

培養(yǎng)并誘導(dǎo)100 mL菌液，超聲破碎后，參照說明書以His-Bind Purification Kit純化目的蛋白，并用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.5 NS1′移碼蛋白片段抗體的制備 將純化的NS1'移碼片段以弗氏完全佐劑乳化，免疫7 周昆明小鼠，每只小鼠接種50 μg抗原，共免疫8只。初免10 d后，以弗氏不完全佐劑乳化的NS1'移碼片段進(jìn)行二免，每只小鼠接種25μg抗原。二免7 d后, 采取小鼠抗血清。

1.6 免疫熒光 將HEN0701以0.5 MOI感染35 mm平皿中的Vero細(xì)胞，細(xì)胞感染后24 h，以1:400稀釋的抗NS1'移碼片段多抗為一抗，參照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。

1.7 Western blot 以 0.5 MOI的HEN0701感染 90 mm平皿中的Vero細(xì)胞，感染18 h后，棄細(xì)胞上清，并以PBS沖洗細(xì)胞1次。按“Western及IP細(xì)胞裂解液”產(chǎn)品說明書操作，收獲細(xì)胞總蛋白。將蛋白液分裝凍存于-70℃，并以BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將變性后的總蛋白以12%SDS-PAGE進(jìn)行分析。參照文獻(xiàn)[9]，分別以NS1單抗和抗NS1'移碼片段多抗為一抗，進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 NS1'移碼片段原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以PNS1F-PNS1R和PNS1HF-PNS1R兩對(duì)引物擴(kuò)增，分別獲得了假定的NS1'移碼片段和His標(biāo)簽與NS1'移碼序列融合片段。并利用BglII和BamH I同尾酶的特性，在pET-28a載體中順向串聯(lián)插入3倍NS1'移碼后編碼序列，獲得表達(dá)質(zhì)粒pET3NS。測(cè)序結(jié)果表明，獲得的原核表達(dá)序列與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致。

2.2 NS1'移碼片段表達(dá)與純化 將pET3NS轉(zhuǎn)化BL-21細(xì)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析顯示，菌體和上清中均存在特異蛋白片段(位于25 kDa和30 kDa間)的表達(dá)(圖1)。經(jīng)過純化，蛋白顯示單一條帶（圖2）。

圖1 表達(dá)蛋白SDS-PAGE分析Fig.1 Analysis of expressed protein by SDS-PAGE

圖2 表達(dá)蛋白的純化Fig.2 Purif i cation of expressed protein

2.3 NS1′移碼片段在JEV感染細(xì)胞中的表達(dá) 以NS1'移碼片段多抗為一抗，對(duì)JEV感染細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果如圖3。JEV感染細(xì)胞呈熒光陽(yáng)性反應(yīng)，而對(duì)照細(xì)胞不顯示熒光.這表明制備的NS1'移碼片段多抗特異性識(shí)別JEV蛋白。為證實(shí)NS1'移碼片段多抗是否識(shí)別NS1'蛋白，分別以NS1單抗和NS1'移碼片段多抗為一抗，對(duì)JEV感染細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，結(jié)果如圖4，以NS1單抗為一抗，Western blot呈現(xiàn)兩條帶，分別為48 kDa NS1和56 kDa的NS1'，NS1與NS1'的比例為3:1，而以NS1'移碼片段多抗為一抗，Western blot僅顯示56 kDa的條帶。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，制備多抗識(shí)別NS1'蛋白, 這表明JEV病毒通過移碼機(jī)制產(chǎn)生NS1'蛋白。

圖3 表達(dá)蛋白的多克隆抗體免疫熒光試驗(yàn)Fig.3 IFA of the polyclonal antibodies against expressed protein

3 討論

圖4 Western blot分析JEV感染細(xì)胞總蛋白Fig.4 Analysis of the total proteins of Vero cells infected with JEV by Western blot

本文在分析NS2A編碼區(qū)中核糖體移碼后編碼序列的基礎(chǔ)上，并通過密碼子的同義突變，合成三條引物, 將假定JEV NS1'移碼片段以3倍重復(fù)克隆入pET-28a載體中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒。 在BL-21E.coli中，3倍串聯(lián)NS1'移碼片段在37 ℃誘導(dǎo)條件下實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，并以純化的NS1'移碼片段免疫小鼠。經(jīng)過兩次免疫制備的多抗血清，可特異性識(shí)別NS1'蛋白。上述結(jié)果說明，本文表達(dá)的蛋白片段即為NS1'移碼片段。

由于核糖體在JEV NS1基因3'末端移碼后僅翻譯45氨基酸即存在終止密碼子，單獨(dú)表達(dá)移碼片段，則表達(dá)片段過小，不易在細(xì)菌中成功表達(dá)。因此，本文在構(gòu)建移碼片段原核表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，設(shè)計(jì)了3倍重復(fù)的移碼片段，移碼片段間以6 His連接, 構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒在E.coli中獲得良好的可溶性表達(dá)。從電泳結(jié)果看, 表達(dá)出的片段比根據(jù)氨基酸序列推測(cè)的蛋白質(zhì)理論分子量(18.156 kDa)要偏大，這可能是由于表達(dá)的片段中含有3個(gè)His標(biāo)簽引致。His是堿性氨基酸，帶有正電荷，能改變蛋白電泳時(shí)的行為，降低泳動(dòng)速率,導(dǎo)致表觀分子量偏大[10]。

核糖體移碼是多順反子mRNA在翻譯過程中調(diào)控基因表達(dá)的一種重要方式。自1985年Jacks和Varmu首次證實(shí)，勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV）pol基因的表達(dá)需要核糖體在gag與pol基因連接處發(fā)生移碼[11]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，核糖體移碼是逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses) 表達(dá)pol基因的一種普遍現(xiàn)象。在多種RNA病毒、細(xì)菌噬菌體和酵母內(nèi)源性病毒的基因表達(dá)中也存在核糖移碼。一些細(xì)菌轉(zhuǎn)座元件基因的表達(dá)及個(gè)別細(xì)菌、酵母、小鼠、大鼠等常規(guī)基因的表達(dá)中，也存在核糖體移碼現(xiàn)象[12,13]。核糖體移碼可分成+1移碼和-1移碼。在病毒中發(fā)生的核糖體移碼多為-1移碼。-1移碼的機(jī)制早已明確，其典型信號(hào)包括兩個(gè)mRNA元件：(1)一個(gè)滑動(dòng)的七聯(lián)核苷酸序列X XXY YYZ，X為任一相同的核苷酸，YYY為AAA或UUU，Z為非G的核苷酸，其中XXY、YYZ為原閱讀框中的密碼子，當(dāng)核糖體移動(dòng)到該位置時(shí)可發(fā)生滑動(dòng)，改變?cè)虚喿x框，使YYY成為新閱讀框密碼子；(2) 滑動(dòng)序列下游存在可形成假結(jié)結(jié)構(gòu)的序列，假結(jié)結(jié)構(gòu)具有促進(jìn)移碼功能。假結(jié)結(jié)構(gòu)與滑動(dòng)序列間距長(zhǎng)為5～6個(gè)核苷酸。核糖體-1移碼效率在1%～40%范圍內(nèi)，不同病毒存在差異[13]。2009年，F(xiàn)irth 等[14]分析認(rèn)為乙型腦炎血清群黃病毒NS2A編碼區(qū)內(nèi)存在病毒移碼信號(hào)。隨后, Melian等[5]通過試驗(yàn)證實(shí)WNV通過核糖體-1移碼機(jī)制翻譯出NS1'蛋白。本文以NS1單抗和假定移碼片段多抗進(jìn)行的Western blot結(jié)果顯示，JEV感染細(xì)胞產(chǎn)生NS1和NS1'蛋白, 而移碼片段多抗僅識(shí)別NS1'蛋白，這表明JEV NS1'蛋白確實(shí)由核糖體-1移碼機(jī)制翻譯出。本文試驗(yàn)結(jié)果也顯示，核糖體移碼產(chǎn)生的JEV移碼產(chǎn)物和非移碼產(chǎn)物間的比例為1:3，則移碼效率約為25%。

由于JEV基因組在翻譯時(shí)發(fā)生核糖體移碼產(chǎn)生NS1'蛋白，并導(dǎo)致感染細(xì)胞內(nèi)非結(jié)構(gòu)蛋白比結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)量降低。 Melian等[5]改變WNV 核糖體-1移碼效率，降低NS1'蛋白表達(dá)可使WNV毒力下降，但毒力下降的機(jī)制還不明確。在逆轉(zhuǎn)錄病毒中，核糖體移碼不僅調(diào)控表達(dá)參與病毒復(fù)制的pol蛋白，且核糖體移碼調(diào)控的Gag與Gag-pol間的比例對(duì)病毒粒子的形成也具有重要影響[15]。在JEV基因組中，核糖體移碼對(duì)病毒復(fù)制循環(huán)的影響尚不確定，移碼產(chǎn)生的NS1'蛋白功能也不明確，有待深入研究。

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