朱建平，周艷君，王亞欣，虞凌雪，吳玉璐，童 武，姜一峰，朱禮倩，于 海，童光志

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是以妊娠母豬繁殖障礙及仔豬出現(xiàn)呼吸道疾病為特征的傳染病[1,2]，主要是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV)引 起 的。PRRSV屬動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒[3,4]。PRRS自被發(fā)現(xiàn)以來，一直是嚴(yán)重危害各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的一個(gè)重要疫病。

中國(guó)在1995年發(fā)現(xiàn)PRRS疫情，1996年首次分離獲得該病病原[5]，自此該病一直持續(xù)在中國(guó)豬群中流行。2006年新的高致病性PRRSV變異株在中國(guó)出現(xiàn)，使得由該病原造成的疫情變得復(fù)雜和嚴(yán)重。高致病性PRRSV與中國(guó)2006年以前分離經(jīng)典毒株相比最大的特點(diǎn)是存在1+29個(gè)氨基酸的缺失，同時(shí)基因組中還存在一些核苷酸的變異[6-8]。發(fā)生變異的PRRSV不僅致病性增強(qiáng)，而且對(duì)細(xì)胞的感染特性也發(fā)生了變化，以前報(bào)道的經(jīng)典PRRSV分離株一般都是利用豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages, PAM）分離成功，而后才適應(yīng)在傳代細(xì)胞Marc-145細(xì)胞中培養(yǎng)。高致病性PRRSV分離株則與之存在明顯不同，它可以直接在傳代細(xì)胞Marc-145細(xì)胞中分離成功[6,7]。另外，高致病性PRRSV分離株還可以在Marc-145細(xì)胞上連續(xù)傳代致弱，致弱后的毒株可以作為疫苗用于高致病性PRRS的免疫預(yù)防[9-11]，但是究竟是何原因?qū)е峦粊碓吹膬煞N毒株在致病性上存在如此之大的差異，尚未見報(bào)道。由于PRRSV在體內(nèi)感染的靶細(xì)胞主要是PAM，而PAM是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞：一方面PAM可以通過吞噬作用殺滅或清除病原體，另一方面，PAM還通過抗原遞呈、分泌各種細(xì)胞因子等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，因此在機(jī)體的免疫防御體系中具有重要作用。PRRSV可以在感染的PAM細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄、復(fù)制產(chǎn)生子代病毒粒子[11]，那么強(qiáng)、弱毒在感染PAM細(xì)胞后是否也存在差異？本研究擬利用PRRSV的強(qiáng)毒HuN4株及其傳代致弱的HuN4-F112株作為研究對(duì)象，通過比較具有不同致病性的PRRSV在感染靶細(xì)胞PAM之間的生物學(xué)特性的異同，為更加深入了解PRRSV的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與實(shí)驗(yàn)豬 高致病性PRRSV分離株HuN4株與弱毒疫苗HuN4-F112株均由本實(shí)驗(yàn)室分離、傳代和保存[6,7,10]；新生健康仔豬購(gòu)于上海交通大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑與抗體 抗PRRSV N蛋白的單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存[13,14]；抗GAPDH單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；山羊抗小鼠IgG熒光標(biāo)記二抗購(gòu)于Invitrogen公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)于中杉金橋；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基均購(gòu)于GIBCO；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；化學(xué)發(fā)光試劑SuperSignal?West Pico Chemiluminescent Substrate購(gòu)于Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 PAM 的分離 選取新生的健康仔豬按照參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法分離豬肺泡巨噬細(xì)胞[15]。然后將灌洗出的PAM細(xì)胞通過細(xì)胞計(jì)數(shù)，將其數(shù)量調(diào)整為2×106/mL，用含10%FBS 、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以每孔2×106個(gè)細(xì)胞/60×15 mm鋪培養(yǎng)板，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.2.2 病毒感染 當(dāng)PAM細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)到95%以上時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞，然后分別接種103TCID50的HuN4株和HuN4-F112株。感染1 h后，棄去培養(yǎng)液，更換成含2%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并適時(shí)觀察細(xì)胞病變。

1.2.3 間接免疫熒光檢測(cè) 分別收獲用HuN4株和HuN4-F112株感染36 h的PAM細(xì)胞，經(jīng)80%的無水乙醇固定和PBS洗滌后，加入抗PRRSV N蛋白的單抗，37℃作用45 min后，經(jīng)PBS洗滌3次，加入適量稀釋的熒光二抗，37℃孵育45 min，PBS洗滌后，于熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 Western blot分析N蛋白的表達(dá) 分別在12、24、36、48、60 h收獲 HuN4株和HuN4-F112株感染的PAM細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS（pH7.2）洗滌3次，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min，然后刮取裂解的細(xì)胞移至1.5 mL離心管中，4℃、13 000×g離心10 min，收獲上清液，根據(jù)BCA試劑盒使用說明測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度。分別取等量的細(xì)胞總蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)印到NC膜上，利用N蛋白單抗進(jìn)行Western blot分析，同時(shí)用鼠抗GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線的繪制 分別在HuN4株和HuN4-F112株感染PAM細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞后12 、24、36、48、60 h收獲病毒液，然后在Marc-145細(xì)胞上按文獻(xiàn)報(bào)道的方法測(cè)定不同時(shí)間的病毒滴度[13]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞病變觀察與IFA檢測(cè) 強(qiáng)毒HuN4株感染PAM細(xì)胞后24 h開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，48 h大量細(xì)胞破碎、脫落，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，弱毒HuN4-F112株感染PAM細(xì)胞后48 h未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，僅有少量細(xì)胞脫落（見圖1）。利用抗PRRSV N 蛋白的單抗進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示在強(qiáng)毒HuN4株感染的PAM細(xì)胞中可見到大量的特異性綠色熒光，而弱毒HuN4-F112株感染的PAM細(xì)胞中僅見到少量存在的綠色熒光（見圖2）。

圖1 強(qiáng)毒HuN4株與弱毒HuN4-F112株感染Marc-145和PAM細(xì)胞48 h后細(xì)胞病變結(jié)果(×200)Fig.1 Cell pathogenic effect of HuN4 and HuN4-F112 in Marc-145 and PAM, respectively(×200)

2.2 不同毒株感染PAM后N蛋白表達(dá)變化 對(duì)強(qiáng)毒HuN4株和HuN4-F112株感染PAM細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞后不同時(shí)間病毒N蛋白表達(dá)量的變化，進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，強(qiáng)毒HuN4株感染PAM細(xì)胞后12 h就可以檢測(cè)到N蛋白，其后隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，N蛋白量也逐漸增加，24～36 h表達(dá)量達(dá)到最大；而弱毒HuN4-F112株在感染PAM細(xì)胞后36 h可檢測(cè)到少量N蛋白，其后表達(dá)量略有增加。在Marc-145細(xì)胞上弱毒HuN4-F112株的感染后N蛋白的表達(dá)量在感染早期則明顯優(yōu)于強(qiáng)毒株（圖3）。

圖2 強(qiáng)毒HuN4株與弱毒HuN4-F112株感染Marc-145細(xì)胞和PAM細(xì)胞后IFA檢測(cè)結(jié)果（×200）Fig.2 IFA detection of HuN4 and HuN4-F112 in Marc-145 and PAM（×200）

圖3 Western blot檢測(cè)PRRSV感染PAM細(xì)胞與Marc-145細(xì)胞后N蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blot detection of PRRSV N protein of HuN4 and HuN4-F112 in Marc-145 and PAM

2.3 強(qiáng)、弱毒株在PAM細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性分析利用多步法，分別繪制了強(qiáng)、弱毒株在PAM細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，在Marc-145細(xì)胞，弱毒HuN4-F112株的增殖特性顯著高于強(qiáng)毒HuN4株，而在PAM細(xì)胞上，強(qiáng)毒HuN4株在感染早期的增殖能力明顯高于HuN4-F112株（圖4）。

圖4 HuN4與HuN4-F112感染PAM細(xì)胞與Marc-145細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定Fig.4 Growth curve of HuN4 and HuN4-F112 in PAM and Marc-145, respectively

3 討論

豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）是PRRSV在豬體內(nèi)感染的主要靶細(xì)胞，在體外利用細(xì)胞系培養(yǎng)時(shí)，非洲綠猴腎細(xì)胞系MA-104及其衍生細(xì)胞系（Marc-145和CL-2621）都能夠支持PRRSV的感染與增殖[16]。其中北美洲型PRRSV對(duì)PAM比CL2621更敏感，當(dāng)然也有的北美洲型PRRSV只能在CL2621細(xì)胞上復(fù)制[17]。通過上述研究，可以看出使用的高致病性PRRSV強(qiáng)毒HuN4株對(duì)PAM的感染性要比體外傳代細(xì)胞系Marc-145細(xì)胞更為敏感，其在感染PAM后24 h就出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變，出現(xiàn)大量細(xì)胞的圓縮、崩解和死亡等，此時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒粒子的含量也明顯增加，病毒滴度也基本達(dá)到峰值。而在Marc-145細(xì)胞中，其增殖速度則相對(duì)遲緩一些。與此相反，弱毒HuN4-F112株對(duì)Marc-145細(xì)胞的感染性則比PAM更為敏感一些，弱毒HuN4-F112株感染Marc-145細(xì)胞后24 h就出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、脫落等典型的細(xì)胞病變，病毒增殖滴度也迅速達(dá)到較高水平，而在PAM細(xì)胞上其增殖速度則較為緩慢。

本研究通過IFA試驗(yàn)可以看到強(qiáng)毒HuN4株和弱毒HuN4-F112株均可以感染PAM細(xì)胞，不同的是強(qiáng)毒株感染后在短時(shí)間內(nèi)就可以檢測(cè)到被感染細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的大量熒光，而弱毒HuN4-F112株感染細(xì)胞產(chǎn)生的熒光則相對(duì)要少，可見，強(qiáng)毒株對(duì)PAM細(xì)胞的感染性明顯高于弱毒株。為了深入探討強(qiáng)弱毒對(duì)PAM細(xì)胞的感染能力的差異，我們從病毒感染后核蛋白的合成水平對(duì)強(qiáng)弱毒之間進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示，強(qiáng)毒株HuN4株的病毒核蛋白在感染PAM細(xì)胞早期就迅速達(dá)到了高峰，且顯著高于弱毒；而弱毒HuN4-F112株在感染PAM細(xì)胞后36 h才檢測(cè)到低水平表達(dá)的核蛋白，且維持在較低水平，由此可見強(qiáng)、弱毒在PAM細(xì)胞上的感染和增殖能力存在明顯差異。

通過觀察強(qiáng)、弱毒株在PAM細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線，可以看到在Marc-145細(xì)胞，弱毒HuN4-F112株的增殖特性顯著高于強(qiáng)毒HuN4株，而在PAM細(xì)胞上，強(qiáng)毒HuN4株在感染早期的增殖速度明顯高于HuN4-F112株。由此可見強(qiáng)毒HuN4株和弱毒HuN4-F112株在PAM細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性差異與兩者對(duì)機(jī)體具有不同致病性密切相關(guān)。PAM是機(jī)體的免疫防御細(xì)胞，在宿主的天然免疫和特異性免疫中均發(fā)揮重要作用。我們推測(cè)強(qiáng)毒株與弱毒株之間存在明顯的致病性的差異，與二者對(duì)機(jī)體內(nèi)靶細(xì)胞PAM的感染能力具有直接的相關(guān)性。強(qiáng)毒HuN4株感染可迅速使PAM細(xì)胞遭受破壞，導(dǎo)致其免疫防御功能喪失，進(jìn)而使機(jī)體的疾病進(jìn)程加快；而弱毒株雖然可以感染PAM細(xì)胞，但是其對(duì)PAM細(xì)胞感染能力顯著低于強(qiáng)毒株，或許這種感染能力不足以破壞其完整免疫系統(tǒng)，反而會(huì)激發(fā)其免疫調(diào)節(jié)功能，因此弱毒疫苗株HuN4-F112株能夠?yàn)闄C(jī)體提供免疫保護(hù)而不會(huì)造成肺部損傷[9]。但是究竟是何原因?qū)е氯醵局陮?duì)PAM細(xì)胞的感染能力降低還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來確定，本研究結(jié)果的獲得為我們深入探討PRRSV強(qiáng)毒HuN4株與弱毒HuN4-F112株對(duì)機(jī)體致病性差異提供了理論依據(jù)。

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