劉 健，鞠厚斌，張維誼，楊德全，王 建，劉佩紅，周錦萍

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV-2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的主要病原。自1991年P(guān)MWS在北美洲最先發(fā)現(xiàn)以來，已在世界范圍內(nèi)流行[1]。臨床癥狀主要表現(xiàn)為生長緩慢、貧血、呼吸困難、腎病、黃疸等，更重要的是，PCV-2在淋巴系統(tǒng)中增殖可導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能下降[2]，造成其他病毒、細(xì)菌性疾病的并發(fā)或繼發(fā)，使病情加重。由于PCV-2 經(jīng)常與多種病毒混合感染[3]，因此，能夠引起豬群發(fā)生多種疾病。PMWS既可水平傳播，導(dǎo)致斷奶仔豬發(fā)病死亡，亦可垂直傳播，引起繁殖障礙[4]，它給養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。

PCV-2為無囊膜環(huán)狀單鏈的DNA病毒，基因組大小1767 bp或1768 bp，許多學(xué)者將其分為PCV-2a（PCV2-2）和 PCV-2b（PCV2-1）兩種亞型，其中PCV-2a基因組全長1768 bp，主要報道的國家為中國和歐洲國家；PCV-2b基因組全長1767 bp，在世界范圍內(nèi)呈普遍感染狀態(tài)[4]。而歐盟根據(jù)PCV-2全基因組在進(jìn)化樹上遺傳距離大小的不同將其分為5個亞型，分別為PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d和 PCV-2e，其中 PCV-2a和 PCV-2e都屬于傳統(tǒng)分類方法中的PCV-2a，PCV-2b、PCV-2c和PCV-2d屬于傳統(tǒng)分類方法中的PCV-2b。在歐洲和北美，2種基因型均已被證實(shí)與豬圓環(huán)病毒病（porcine circovirus associated disease, PCVAD）有關(guān)，2005年美國暴發(fā)的PCVAD也被證實(shí)與PCV-2b有聯(lián)系。盡管大多數(shù)豬群感染和PCV-2有關(guān)，但是有學(xué)者認(rèn)為PCV-2的兩個不同基因型在臨床表現(xiàn)并不相同，即兩者的毒力不同，普遍認(rèn)為PCV-2b的致病性要強(qiáng)于PCV-2a[5]。但是也有學(xué)者認(rèn)為PCV-2a和PCV-2b的毒力沒有差異，并且二者存在交叉保護(hù)力[6]。

本研究采用PCR 方法從臨床樣品中克隆得到PCV-2的全基因組重組質(zhì)粒，并對其序列進(jìn)行分析，旨在探索PCV-2的變異規(guī)律，從而為研究PCV-2的分子生物學(xué)、流行病學(xué)、致病機(jī)理等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 陽性病料 PCV-2陽性病料來源于上海市發(fā)病豬場，共12份，其中2009年2株、2010年和2011年各5株。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒購自上海睿安生物科技有限公司，批號：DN-VR-100；10×Buffer、dNTP、rTaq聚合酶、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、HindⅢ、DL2000 Marker均購自大連TaKaRa生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20110401。

1.3 DNA提取 根據(jù)DNA提取試劑盒說明書要求，提取待檢樣品的DNA，加入100 μL DEPC水溶解，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCV-2全基因片段的擴(kuò)增 PCV-2全基因核苷酸大小為1767 bp或1768 bp。根據(jù)GenBank中 的PCV-2已 知 序 列（AY484413和AY322004）設(shè)計(jì)1對特異性引物，用于擴(kuò)增PCV-2全基因序列。上游引物PCV-U：5'-GGCAGCACCTCAGCAGCAACAT-3'；下游引物PCV-D：5'-GGCGTTACCGAAGGAGAAGACA-3'，由上海鼎安生物工程有限公司合成，用DEPC水稀釋為25 pmol/L濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)采用50 μL反應(yīng)體系，其中10×Reaction Buffer（Mg2+free）5.0 μL、MgCl2(25 mmol/L) 4.0 μL、dNTP (2.5 mmol/L) 4.0 μL、 引 物PCV-V（25 μmol/L）1.0μL、 引 物 PCV-D（25 μmol/L）1.0μL、cDNA10.0 μL、TaqDNA 聚合酶10個單位，加滅菌蒸餾水至50.0 μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，58℃退火50 s，72℃延伸120 s，共34個循環(huán)；72℃延伸10 min后，4℃保存。

1.5 PCV-2 全基因的克隆及鑒定 將PCR陽性目的條帶進(jìn)行膠回收，按照DNA膠回收試劑盒的步驟進(jìn)行，取回收產(chǎn)物與T載體連接，連接反應(yīng)體系：回收的PCR產(chǎn)物7 μL，10×連接緩沖液1μL，T載體1 μL，DNA連接酶1 μL，4℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，在IPTG、X-gal誘導(dǎo)下37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取白斑菌落接種LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ進(jìn)行陽性重組子的雙酶切鑒定。1.6 PCV-2 全基因核苷酸序列的測定與分析 取上述經(jīng)雙酶切鑒定的陽性重組質(zhì)粒送上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，利用DNASTAR軟件將測序結(jié)果同已發(fā)表的PCV-2全基因核苷酸序列進(jìn)行比較，確定各PCV-2分離株與已發(fā)表的PCV-2全基因核苷酸序列的同源性。同時繪制PCV-2全基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹，所用的PCV-2各毒株GenBank登錄號、登錄時間、基因亞型和來源地見表1。

表1 用于核苷酸序列分析的PCV-2毒株Table 1 PCV-2 strains for sequence alignment

2 結(jié)果與討論

2.1 PCV-2全基因擴(kuò)增 以病毒DNA為模板，利用特異性引物，通過PCR方法均擴(kuò)增出約1767/1768 bp的特異性條帶，其大小與預(yù)期完全相符（見圖1）。

圖1 PCV-2陽性樣本全基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplif i cation of cDNA sequences of PCV-2

2.2 全基因核苷酸同源性分析 將12株陽性樣品的全基因序列與已知參考序列進(jìn)行比對，獲得核苷酸序列的同源性結(jié)果（見表2）。比對結(jié)果表明，12株陽性樣品全基因序列同源性在95.0%～100%，與5株已知毒株的同源性在93.8%～98.5%。

2.3 PCV-2遺傳進(jìn)化樹分析 應(yīng)用DNAStar分析軟件通過ClustraWl（Slow/Accurate， IBU）方法比對12個PCV-2分離株全基因組序列與GenBank已經(jīng)發(fā)表的PCV-2全基因組序列。通過ClustalX1.83分子生物學(xué)軟件比較分析并用MEGA3.1繪制了PCV-2全基因組進(jìn)化樹（見圖2）。12株病毒中有3株屬于PCV-2a，9株屬于PCV-2b。

2.4 氨基酸序列中強(qiáng)毒株和弱毒株氨基酸位點(diǎn)差異性分析 將全基因序列中ORF2序列進(jìn)行氨基酸序列比對，根據(jù)PCV-2強(qiáng)毒株和弱毒株氨基酸位點(diǎn)差異[7]（見表3），比較PCV-2b與PCV-2a毒力差異，見圖3。根據(jù)基因進(jìn)化樹分析，其中 GQ359003、M20091009、M20110403-2和M20110519-2為PCV-2a亞型，其余的為PCV-2b亞型，根據(jù)宋勤葉等[7]研究，PCV-2強(qiáng)毒株在ORF2氨基酸76位為I，131位為T，而弱毒株76位為L，131位為P或I。本研究測序的ORF2結(jié)果表 明，GQ359003、M20091009、M20110403-2和M20110519-2 4株病毒在76位為L，其余毒株在76位為I，131位為T，131位為P或I，說明4株P(guān)CV-2a為弱毒株，其余毒株為強(qiáng)毒株，本研究從基因型角度證明了PCV-2a為弱毒株，PCV-2b為強(qiáng)毒株。

表2 12株P(guān)CV-2病毒全基因核苷酸同源性Table 2 Homologous comparisons of nucleotide sequence of 12 PCV-2 isolates

圖2 12株P(guān)CV-2 分離株基因進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of twelve PCV-2 isolates

表3 PCV-2強(qiáng)毒株和弱毒株氨基酸位點(diǎn)差異Table 3 Amino acid diversity of PCV-2 high and low virulent isolates

圖3 12株P(guān)CV-2 分離株ORF2氨基酸比對Fig.3 Comparison of ORF2 amino acid sequence of twelve PCV-2 isolates

2.5 豬圓環(huán)病毒2型的感染在我國豬群中已十分普遍，近年來因該病毒的感染所導(dǎo)致的疾病使我國規(guī)?；i場疫病的復(fù)雜程度加大。分析我國PCV-2毒株的基因組，對于研究其分子流行病學(xué)具有十分重要的意義。據(jù)國外報道，病毒在連傳120代的過程中，發(fā)生了堿基突變，使得病毒的復(fù)制能力提高[8]。病毒的變異會導(dǎo)致什么樣的結(jié)果，是否會使毒力增強(qiáng)或減弱，是否會使致病機(jī)制發(fā)生改變還不清楚，到目前為止，還沒有證據(jù)證明不同PCV-2毒株間的致病性有何差異[9,10]。因此，對PCV-2全基因測序分析，有助于了解PCV-2病毒的遺傳和變異，也有助于了解PCV-2在豬疫病傳播和流行過程中所起的作用和地位，以及提供有效的防治措施。

通過對上海市分離株進(jìn)行全基因組的測定分析，其基因進(jìn)化樹分析表明12株上海株有9個分離株的全長為1767 bp，屬于PCV-2b亞型；3個分離株全長為1768 bp，屬于PCV-2a亞型，上海市PCV-2感染已PCV-2b亞型感染為主，但是PCV-2a亞型的感染也是存在的。PCV-2分離株基因組的同源性高達(dá)95.0%～100%，并且與GenBank中其他國家的分離株有較高的相似性。由本研究可以看出，上海地區(qū)分離株與國內(nèi)分離的2株分離株（AY181946、GQ359006）的親緣關(guān)系近，世界范圍內(nèi)不同地域的PCV-2分離株的基因序列差異也不大。本研究通過對上海市PCV-2序列的分析及同源性的研究，明確了目前上海市PCV-2流行毒株基因組的基因亞型及其分子流行病學(xué)特征。

本研究通過測序方法比對了PCV-2 ORF2的氨基酸序列，結(jié)果表明，PCV-2b在76位為I，131位為T，PCV-2a毒株76位為L，131位為P或I，根據(jù)已有資料報道[7]，證明了PCV-2b為強(qiáng)毒株，PCV-2a為弱毒株，從基因型方面證實(shí)了PCV-2b毒力要強(qiáng)于PCV-2a，而鑒于上海市PCV-2b感染比例較高，且呈逐年上升趨勢，應(yīng)當(dāng)引起相關(guān)部門的重視。

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