王隆柏，吳學敏，車勇良，陳如敬，魏 宏，劉玉濤，莊向生，周倫江

（福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心，福州 350013）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起豬的一種高度接觸性的急性腸道傳染病，常導致病豬水樣腹瀉、嘔吐、脫水，消化道粘膜發(fā)炎、出血及糜爛[1,2]。不同年齡和不同品種的豬均易感，但對哺乳仔豬的危害最為嚴重，1周齡以內(nèi)的哺乳仔豬發(fā)病后2～4 d死亡，致死率高達90.0%以上，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3,4]。自從1971年英國首次報道PEDV以來，相繼在比利時、德國、加拿大、日本、瑞士等多個國家均有本病發(fā)生的報道[5,6]，中國從1976年開始陸續(xù)有PEDV的報道[7]，隨后全國26個省市自治區(qū)均有發(fā)生。近年來，PEDV的流行區(qū)域有逐漸擴大的趨勢，并已成為影響中國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要病毒性腹瀉病之一。2010年底出現(xiàn)在中國部分省市的仔豬“頑固性腹瀉”病，主要導致哺乳小豬出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐、脫水等臨床特征和腸壁變薄、黏膜脫落等主要病理特征，具有發(fā)病地區(qū)多、發(fā)病率和死亡率高等特點。本研究于2011年對福建省患有仔豬“頑固性腹瀉”疫病的8個不同規(guī)模豬場的16份仔豬病料進行了PEDV檢測，從中選出4個有代表性規(guī)模豬場的陽性病料進行了PEDV的ORF3和M基因克隆和序列分析。

1 材料與方法

1.1 病料采集 從福建省8個不同規(guī)模豬場隨機采集了16份發(fā)病仔豬的小腸，發(fā)病豬的主要臨床癥狀為0～5日齡的哺乳仔豬“頑固性腹瀉”，其發(fā)病率和死亡率均在90%以上。

1.2 主要試劑 TRIzol購自Invitrogen 公司；AMV酶、dNTP、MgCl2、DNA Marker（DL2000）購 自 TaKaRa公 司；GoTaqGreen Master Mix、Nucleanse-Free Water購自Promega公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自OMEGA公司；氯仿和異戊醇均為分析純。

1.3 引物設計 參照GenBank 登錄的PEDV CV777ORF3和M基因保守區(qū)分別設計了2對引物，ORF3-F: 5'-AAGGTCCACGTGCAGTGATGT-3',ORF3-R：5'- TACTAGACCATTATCATTCAC-3'，擴增目的片段大小為705 bp；M-F：5'-CCCCA GTACTGTTATTGACGTATAAAC-3'，M-R：5'-GTTTAGACTAAATGAAGCACTTTC -3'；擴增目的片段大小為715 bp，由大連寶生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 病毒總RNA提取 取4 g腸道樣品，加入2倍體積的TE緩沖液研磨成懸液，反復凍融2～3次，12 000×g離心10 min。吸取研磨組織上清200 μ L，加入800 μL的Trizol，混勻10次，室溫靜置5 min。加入70 μL的乙酸鈉和200 μL氯仿:異戊醇（24:1），劇烈混勻2 min，室溫靜置15 min后，4℃12 000×g離心15 min。緩慢吸取上清600μ L轉入無菌小管中，加入等量異丙醇，-20℃靜置30 min，12 000×g離心15 min，棄上清。加入200 μL的70%乙醇進行洗滌，并于4℃7500×g離心15 min，棄去清，超凈臺干燥25 min，用30μL DEPC水溶解沉淀，-20℃保存。

1.5ORF3和M基因擴增、克隆及測序 RT反應體系：DEPC 水 1.25 μL、5×AMV Buffer 2.0 μL、25 mg MgCl21.0 μL、dNTP mixture 1.0 μL、RNase inhibitor 0.25 μ L、AMV 0.5 μ L、隨機引物 1.0 μL、RNA樣品模版3.0 μL、組成10.0 μL體系。RT反應條件：30 ℃ 10 min ，42 ℃ 1 h ，99 ℃ 5 min。PCR 反應體系：Nucleanse-Free Water 10.0μ L、GoTaqGreen Master Mix 10.0 μ L、上游引物 0.5 μ L、下游引物 0.5 μL、RT反應產(chǎn)物 4.0 μL，組成 25.0 μL體系進行擴增。ORF3擴增片段反應條件：95℃ 預變性5 min后進入循環(huán)，94℃變性1 min，48℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)后，72℃延伸10 min，4℃保存；M擴增片段反應條件：95℃預變性5 min后進入循環(huán)，94℃變性1min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)后，72℃延伸10 min，4℃保存。反應結束后，PCR產(chǎn)物于1% 瓊脂糖進行凝膠電泳，回收產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，進行藍白斑及氨芐青霉素抗性篩選，陽性菌株送生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.6ORF3和M基因序列分析 將獲得序列與GenBank中登錄的26株PEDVORF3和M 基因進行同源性分析，這些病毒包括中國大陸分離毒株 CH HNCH 06（EU033963）、CH IMB 06（EU033962）、CH IMT 06（GU372739）、CH HLJ 06（EU033964） 、CH SHH 06（GU372740）、XD（EU031893）、CH HBXX2 11（JN584168）、CH HBQX 10（JN547395）、CH JL 09（GU372741）、CH XXHJ 11（JN547392）、CH ZKFG 11（JN547399） CH NYWL 11（JN584171） 、GDYA（JN089729） 和 致 弱 CV777 truncated（GU372744），韓國分離毒株PFF188（FJ687462）、CPF193（FJ687463）、CPF259（FJ687465）、CPF531（FJ687471）、M2227（HQ537439）、BIF256（HQ537447） 和 attenuated DR13 弱 毒株（EU054929），泰國分離毒株KU05CB08（FJ196193）、KU04RB08（FJ196192）、KU03CB08（FJ196191） 和 M_NIAH100541_08（EU542416），日本分離毒株D89752及英國分離標準株毒株CV777（AF353511）。

2 結果與討論

2.1 樣品檢測結果 16份腸道樣品RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示樣品均能擴增出M基因片段，從中選出4個不同規(guī)模豬場的陽性病料進行ORF3和M基因擴增，均能擴增出目的片段，其中ORF3基因片段大小約為705 bp （圖1），M基因片段大小約為 715 bp（圖2）。將陽性產(chǎn)物進行了序列測序，獲得了4株PEDV序列，命名為FJFZ、FJFQ、FJPT和FJNP，相應ORF3基因和M基因序列已登錄GenBank，登錄號分別為 JQ678033、JQ678034、JQ678035、JQ678036、JQ678037、JQ678038、JQ678039 及 JQ678040。

圖1 豬流行性腹瀉ORF3基因擴增電泳圖Fig.1 RT-PCR products of ORF3 fragments from PEDV

圖2 豬流行性腹瀉M基因擴增電泳圖Fig.2 RT-PCR products of M fragments from PEDV

2.2ORF3和M基因的同源性比較分析 運用DNAStar軟件中的Clustal W method對4個毒株ORF3與M基因序列進行比對分析，結果顯示：4株PEDVORF3基因均含675個堿基，編碼224個氨基酸，它們之間核苷酸的同源性為96.9%～99.9%，氨基酸的同源性為96.6%～99.1%，與GenBank中登錄的代表性PEDV核苷酸的同源性為89.7%～100.0%，氨基酸的同源性為94.7%～99.6%。其中FJPT毒株的核苷酸的同源性與CV777truncated毒株最低，僅為89.7%；FJNP毒株的核苷酸的同源性與中國北方流行CH ZKFG 11毒株最高，達100.0%。另外，4株PEDV毒株的ORF3基因片段均比attenuate DR13弱毒株多17個氨基酸（圖3）。4株PEDV毒株M基因含有681個堿基，編碼226個氨基酸，它們之間核苷酸的同源性為96.8%～99.6%，氨基酸的同源性為96.0～98.7%，與GenBank中登錄的代表性PEDV核苷酸的同源性為94.8%～100.0%，氨基酸的同源性為94.8%～99.6%。其中FJPT毒株核苷酸的同源性與日本D89752毒株最低，僅為94.8%；FJNP毒株核苷酸的同源性與韓國CPF193、泰國毒株的最高，達100.0%。

2.3 PEDVORF3和M基因的遺傳進化樹分析 根據(jù)遺傳進化樹分析表明， 4株PEDV在ORF3基因劃分成2個主分支，其中FJFZ、 FJFQ及FJNP毒株與韓國毒株、中國大陸毒株處于一大分支，而FJPT毒株單獨于另一分支。4株流行毒株均與強毒株的親緣關系較近，與attenuate DR13弱毒株和致弱的CV777truncated毒株的親緣關系較遠（圖4）。4株M基因中FJFZ毒株和FJPT毒株與CV777標準毒株處于同一小分支，親緣關系較近；而FJFQ毒株和FJNP毒株與中國大陸和泰國流行毒株處同一分支（圖5）。

圖3 PEDV ORF3氨基酸序列比較Fig.3 The amino acid sequence comparison of ORF3 of PEDV

圖4 4株PEDV ORF3基因核苷酸遺傳進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on ORF3 gene of the four PEDV strains

圖5 4株PEDV M基因核苷酸遺傳進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of M gene based on the four PEDV strains

2.4 PEDV 屬于尼多病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronavi ridae）、冠狀病毒屬（Coronavirus），其基因組是單股正鏈具有感染性的RNA，與其他冠狀病毒相似，整個基因組長度為27 000～33 000個核苷酸（nucleotide，nt ），其基因組5'端有一個帽子結構（cap ）， 3'端有1個Poly（A） 尾，剩余基因組序列包括6個ORF, 從5'- 3'端依次為編碼復制酶多聚蛋白1ab（pp1ab）、纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）的基因[8,9]。通過限制性片段長度多態(tài)性分析適應Vero細胞的弱毒PEDV和野毒PEDV的ORF3，發(fā)現(xiàn)ORF3與病毒毒力有關[10]。M蛋白在病毒粒子的組裝和出芽過程中具有重要作用，另外，M蛋白能介導機體產(chǎn)生α干擾素，所以M蛋白可以作為PEDV基因工程疫苗的候選抗原，并已成為開展PEDV血清學診斷抗原的主要蛋白之一[11]。因此，開展PEDV的ORF3和M基因的分子遺傳變異分析，對于明確現(xiàn)階段流行毒株的分子生物學特征具有重要意義。

PEDV自20世紀發(fā)現(xiàn)以來，病毒的體外繁殖一直是制約該病研究深入的瓶頸，雖然有報道在Vero細胞培養(yǎng)液中加入胰酶可以分離到病毒[12]，但在研究過程中發(fā)現(xiàn)，病毒在細胞中繁殖困難而容易丟失。本研究從福建省不同地區(qū)的4個代表性規(guī)模豬場發(fā)生 “頑固性腹瀉”仔豬的小腸中，擴增出了PEDV的ORF3和M基因。4個毒株的ORF3均含有675個堿基，編碼224個氨基酸，比attenuate DR13弱毒株多17個氨基酸，氨基酸的變化可能誘導PEDV毒株的毒力增強，使豬群發(fā)病嚴重，死亡率升高。核苷酸遺傳進化樹分析表明，4株PEDV毒株的ORF3基因與中國大陸2006年流行和韓國2009年流行的親緣關系較近，與致弱PEDV毒株親緣關系較遠，但FJPT毒株遺傳變異較大，單獨另處于分支, 從而表明了PEDV 的ORF3基因存在易變異的區(qū)域片段，進化相對比較不穩(wěn)定。M基因片段與CV777和泰國流行毒株的親緣關系較近，驗證了PEDV的M基因在遺傳進化上是比較保守、穩(wěn)定。

通過對福建省不同規(guī)模豬場仔豬“頑固性腹瀉”疾病的病料進行RT-PCR擴增，從中擴增出4株PEDV的ORF3和M基因，并完成了相應基因的序列測定。同時，筆者也對采集自8個不同規(guī)模豬場的16份病料進行了豬瘟、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒及博卡病毒檢測，結果均為陰性，由此表明PEDV是導致福建省仔豬“頑固性腹瀉”的主要病原。通過基因序列分析，明確了相應基因片段的遺傳進化規(guī)律，為疫病準確診斷和有效防控提供了理論依據(jù)，豐富了PEDV的分子流行病學資料。

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