羅 玄 ，張海濤，尹秀鳳，黃顯明，靳宇田 ，張小飛, ，潘 玲

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；2.南京天邦生物科技有限公司，南京 211102；3.江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所，南京 210014)

I型鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1,DHV-1)是引起雛鴨急性高度致死性傳染病的病原，早在1949年美國(guó)學(xué)者Levine首次分離并報(bào)道了DHV[1]，但直到最近幾年，才有學(xué)者陸續(xù)完成了DHV全基因組序列測(cè)定[2-4]。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)第九次報(bào)告，DHV-1屬于小RNA病毒科Avihepatovirus病毒屬[5]。DHV-1病毒基因組為長(zhǎng)約7.7 kb的單鏈正股RNA分子，含有1個(gè)大的開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)，一級(jí)編碼產(chǎn)物為一個(gè)多聚蛋白前體。該多聚蛋白在隨后的翻譯加工過(guò)程中，可被再次裂解，產(chǎn)生3種結(jié)構(gòu)蛋白(VP0、VP3和VP1)和9種非結(jié)構(gòu)蛋白2A1、2A2、2A3、2B、2C、3A、3B、3C和3D[2]。

由于目前尚無(wú)DHV-1結(jié)構(gòu)蛋白的功能的相關(guān)報(bào)道，為了對(duì)DHV-1 VP3蛋白的免疫學(xué)功能進(jìn)行研究，本試驗(yàn)嘗試對(duì)隨機(jī)選擇的vp3截短基因進(jìn)行表達(dá)，以獲得VP3蛋白的部分截短蛋白，為將來(lái)為DHV-1 VP3蛋白的抗原表位、診斷試劑和新型疫苗等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體和血清 DHV-1 A66株為安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的雞胚適應(yīng)株；工程菌DH5α、Rosetta-gami(DE3) pLysS、表達(dá)載體pET-32a(+)均由南京天邦生物技術(shù)研究所保存；克隆載體pMD 18-T購(gòu)自TaKaRa公司；DHV-1陽(yáng)性、陰性血清為南京天邦生物技術(shù)研究所制備及保存。

1.2 主 要 試 劑 RNAiso Plus、M-MLV反 轉(zhuǎn) 錄酶、RNA酶抑制劑、T4 DNA連接酶、DL 2000 Marker、rTaqDNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit均購(gòu)自TaKaRa公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鴨IgG二抗購(gòu)自KPL公司；Ni-NTA HiBind Purification Kit購(gòu)自Novagen 公司；BCA蛋白定量試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司；DEAE-Sepharose陰離子柱購(gòu)自北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank登錄的DHV-1(A66株，DQ886445) vp3基因序列1-468位設(shè)計(jì)引物，上游引入BamH I位點(diǎn)，下游使用vp3自帶的EcoRI酶切位點(diǎn)。將vp3基因序列1-468位命名為vp468。陽(yáng)性克隆篩選用Novagen公司pET系列載體通用引物T7 promoter primer#69348-3和T7 terminator primer #69337-3。引物如下（下劃線部分為酶切位點(diǎn)）：

FVP468：5'-CTC GGA AAG CGT AAA CCA T-3'（BamH I）

RVP468：5'-G GAA TTC TGG CAT TGT GCC AAG CTC-3' (EcoR I)

FT7 promoter primer：5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'

RT7 terminator primer：5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3'

1.4 病毒RNA的提取 DHV-1 A66株接種于8～10日齡雞胚尿囊腔，收集24～96 h內(nèi)死亡的雞胚組織，按照TaKaRa RNAiso Plus說(shuō)明書提取病毒總RNA。

1.5 目的基因vp468的擴(kuò)增 采用TaKaRa公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)過(guò)程按說(shuō)明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增使用25 μL反應(yīng)體系，取上述反應(yīng)的cDNA 模板2 μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃ 預(yù)變性3 min；94℃ 變性 30 s，57℃ 退火 30 s，72℃ 延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收目的片段。目的片段連接到pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落，進(jìn)行菌落PCR（引物FVP468，RVP468）鑒定。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pMD-VP468。

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將1 μg pET-32a(+)和1 μg pMD-VP468分別經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切（10 μL體系，3 h），1%的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收約5800 bp的pET-32a(+)片段和468 bp的vp468片段。連接反應(yīng)使用10 μL體系，pET-32a(+)片段與vp468片段按照摩爾比1:3，16℃連接過(guò)夜，重組質(zhì)粒命名為pET-VP468。取連接產(chǎn)物1 μL，TSS法轉(zhuǎn)入200 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞：連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合后，冰上放置30 min，加入SOC培養(yǎng)基800 μL 37℃ 振蕩培養(yǎng)30～60 min，均勻涂布于氨芐青霉素抗性平板。陽(yáng)性克隆篩選使用菌落PCR法，引物為通用引物FT7 promoter primer和 RT7 terminator primer。 提取鑒定正確的pET-VP468質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 重組質(zhì)粒的原核表達(dá) 將陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒pET-VP468與對(duì)照載體pET-32a(+)分別轉(zhuǎn)化E.coliRosetta-gami (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞。分別挑取單個(gè)菌落，接種于5 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中，搖床（37℃，250 r/min）培養(yǎng)至OD600值約1，將菌液710×g離心10 min，棄去上清。將菌體沉淀用5 mL含200 μg/mL氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基重新懸浮，加入終濃度1.0 mmol/L的IPTG振蕩培養(yǎng)（37℃，250 r/min），誘導(dǎo)3 h。硫氧還原蛋白-鴨肝炎截短VP3重組融合蛋白命名為Trx-VP468。

1.8 Trx-VP468 的純化 誘導(dǎo)表達(dá)菌液710×g離心10 min，棄去上清，超聲裂解菌體（裂解緩沖液：20 mmol/L Tris-Cl、150 mmol/L NaCl 、PMSF、pH 8.0），6500×g離心30 min，收集包涵體。溶解包涵體（20 mmol/L Tris-Cl、8 mol//L尿素、500 mmol/L NaCl、40 mmol/L咪唑，pH 8.0），6500×g離心30 min，收集上清。蛋白純化使用Ni-NTA層析柱，按照Novagen 公司Ni-NTA HiBind Purification Kit使用說(shuō)明進(jìn)行，洗脫緩沖液為 20 mmol/L Tris-Cl、8 mol/L尿 素、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑，pH 8.0。洗脫液透析（20 mmol/L Tris-Cl、8mol/L尿素， pH 8.0）去除NaCl，再經(jīng)DEAE-Sepharose陰離子柱進(jìn)一步純化。使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行濃度測(cè)定，蛋白未做復(fù)性保存于8 mol/L尿素中。

1.9 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

1.9.1 SDS-PAGE檢測(cè) 誘導(dǎo)結(jié)束，取80 μL菌液，加入20 μL 5×SDS上樣緩沖液沸水浴10 min，以15%的還原性SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮蘭染色、脫色后觀察結(jié)果，通過(guò)凝膠灰度分析蛋白純度。

1.9.2 Western blot分析 純化后的融合蛋白Trx-VP468經(jīng)15%的還原性SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上（4℃，15 V，過(guò)夜），用含10%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h后與鴨抗DHV-1陽(yáng)性血清（1:200，1%脫脂奶粉，TBST）于37℃作用1.5 h，同時(shí)設(shè)立陰性血清對(duì)照。反應(yīng)完畢，TBST洗滌5 min重復(fù)3次，硝酸纖維素膜與二抗（HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG，1:5000，1%脫脂奶粉，TBST）37℃作用0.5 h，TBST洗滌5 min重復(fù)3次。按照DAB顯色試劑盒使用說(shuō)明，使用1 mL DAB顯色液，室溫避光顯色10 min，自來(lái)水或TBST沖洗終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1vp468基因的擴(kuò)增 提取DHV-1病毒總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，得到一條約470 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果（468 bp）相符（圖1）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，克隆至pMD18-T載體，得到重組質(zhì)粒pMD-VP468。經(jīng)菌落PCR鑒定，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。

圖 1 RT- PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of RT- PCR

圖 2 質(zhì)粒pMD-VP468的鑒定Fig.2 Assessment of plasmid pMD-VP468

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及表達(dá) vp3截短基因vp468亞克隆到表達(dá)載體pET-32a(+)中，經(jīng)T7 Primer PCR鑒定篩選出陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒pETVP468（圖3）。將pET-VP468和空載體pET-32a(+)分別轉(zhuǎn)入E.coliRosetta-gami (DE3) pLysS中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，15%的還原性SDS-PAGE凝膠電泳鑒定顯示，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-VP468表達(dá)出約36 kDa的蛋白產(chǎn)物，載體pET-32a(+)表達(dá)出20 kDa左右的蛋白產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果相符。重組蛋白帶有His標(biāo)簽，使用Ni2+親和層析柱和DEAE-Sepharose陰離子柱進(jìn)行純化，純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳及凝膠灰度分析，蛋白純度約為95%（圖4）。Trx-VP468融合蛋白未做復(fù)性保存于8 mol/L尿素中，經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定，終濃度約為2.5 mg/mL。

圖 3 質(zhì)粒pET-VP468的鑒定Fig.3 Assessment of plasmid pET-VP468

圖 4 融合蛋白Trx-VP468的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein fused Trx-VP468

2.3 Western blot分析結(jié)果 將純化后的Trx-VP468融合蛋白和pET-32a(+)全菌蛋白進(jìn)行還原性SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示融合蛋白Trx-VP468能夠與DHV-1陽(yáng)性血清反應(yīng)，在36 kDa處有一條明顯的蛋白質(zhì)印跡帶，而與DHV-1陰性血清不反應(yīng)，pET-32a(+)全菌蛋白與DHV-1陽(yáng)性血清不反應(yīng)，說(shuō)明表達(dá)的重組蛋白能夠被DHV-1鴨陽(yáng)性血清特異性的識(shí)別，Trx-VP468獲得了正確表達(dá)（圖5）。

圖 5 融合蛋白Western blot 分析結(jié)果Fig.5 Western blotting analysis of the purif i ed fused protein

3 討論

本研究首先擴(kuò)增出DHV-1 vp3截短基因（468 bp），與表達(dá)載體pET-32a(+)連接，構(gòu)建了截短基因重組質(zhì)粒pET-VP468，用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功的表達(dá)了DHV-1 截短的VP3融合蛋白Trx-VP468。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，表達(dá)的截短蛋白Trx-VP468與DHV-1 陽(yáng)性鴨血清可產(chǎn)生特異反應(yīng)，不能與DHV-1陰性血清反應(yīng)，說(shuō)明構(gòu)建的截短蛋白Trx-VP468獲得了正確表達(dá)。

目前，DHV-1的檢測(cè)還依賴于病毒的分離和中和實(shí)驗(yàn)，而ELISA的應(yīng)用受限于抗體的親和力低，靈敏度和穩(wěn)定性較差。因此，我們嘗試使用原核表達(dá)的方法，對(duì)DHV-1的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP3進(jìn)行表達(dá)，用表達(dá)獲得的蛋白制備單抗或多抗，以期為DHV-1檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

由于全基因序列測(cè)定在2006年才完成，在分子水平上對(duì)DHV-1的研究剛剛起步，Pan等[6]率先對(duì)DHV的內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)（internal ribosome binding sites，IRES）進(jìn)行了研究，應(yīng)用缺失突變技術(shù)研究DHV的IRES結(jié)構(gòu)。關(guān)于DHV-1三種結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP1、VP3的功能研究，我們認(rèn)為可以參考小RNA病毒科中其他病毒的研究成果。在小RNA病毒科中，腸病毒的VP1蛋白編碼主要的B抗原位點(diǎn)并具有中和位點(diǎn)[7]。Borca等[8]利用反向遺傳學(xué)和突變技術(shù)證實(shí)FMDV（口蹄疫病毒，F(xiàn)ootand-mouth disease virus）VP3蛋白某些氨基酸的變異可以導(dǎo)致遺傳性狀的改變；Bosch等[9]研究表明HAV（甲型肝炎病毒，Hepatitis A virus） VP3蛋白110～121aa含有一個(gè)連續(xù)的抗原表位在抗病毒感染方面起到一定的作用，另有學(xué)者報(bào)道HAV的T抗原表位主要位于VP3蛋白[10]。

DHV基因組的功能研究尚處于起始階段，VP1和VP3蛋白的功能研究都很少，在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，我們運(yùn)用了截短表達(dá)策略，一方面降低了蛋白表達(dá)的難度，另一方面也為將來(lái)抗原表位的篩選奠定了基礎(chǔ)。vp3基因內(nèi)部含有兩個(gè)EcoR I（463位，601位）酶切位點(diǎn)，另外，也可以利用vp3基因內(nèi)部的其他酶切位點(diǎn)，可以構(gòu)建一系列截短的VP3表達(dá)載體，結(jié)合突變技術(shù)，對(duì)VP3蛋白的功能進(jìn)行研究。本研究首次成功的表達(dá)了VP3蛋白的截短蛋白，為鴨肝炎結(jié)構(gòu)蛋白VP3抗原表位的篩選，以及蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究奠定了良好基礎(chǔ)。

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