趙宗正，涂加鋼，張文婷，胡 勇，周紅波，金梅林

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

流感病毒屬于正粘病毒科，其全基因組由8個(gè)分節(jié)段的負(fù)鏈RNA片段組成，共編碼11種蛋白。2009年4月份爆發(fā)于墨西哥的甲型H1N1流感在短短幾個(gè)月內(nèi)迅速在全球范圍內(nèi)傳播，引起了人們的廣泛關(guān)注。甲型H1N1流感病毒是三源重配病毒，PB2、PA來(lái)自H1N1禽流感病毒，PB1來(lái)自H3N2人流感病毒，HA、NP、NS來(lái)自北美經(jīng)典H1N1豬流感病毒，而NA、M來(lái)自歐系禽源H1N1豬流感病毒[1,2]。

流感病毒的NS1是流感病毒的重要毒力因子，也是流感病毒唯一的非結(jié)構(gòu)蛋白[3]。NS1蛋白起初在宿主細(xì)胞漿合成，然后很快轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并在感染早期積聚在細(xì)胞核，感染后期則積聚于核仁中，形成致密的包涵體[4]，是病毒復(fù)制和傳播的重要調(diào)節(jié)蛋白。NS1蛋白是一個(gè)多功能蛋白，對(duì)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成具有抑制作用，能夠拮抗宿主干擾素的產(chǎn)生，并可以上調(diào)“凋亡閾值”來(lái)延緩宿主細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序[4,5]。Skehel[6]研究發(fā)現(xiàn)，NS1蛋白在病毒復(fù)制的早期就大量表達(dá)，僅出現(xiàn)于被流感病毒感染的細(xì)胞中，而在病毒粒子內(nèi)部不存在NS1蛋白，因此通過(guò)血清學(xué)方法可以用來(lái)區(qū)別滅活苗免疫與野毒感染的動(dòng)物。甲型流感病毒的NS1蛋白含有202～237個(gè)氨基酸，不同的毒株之間存在著長(zhǎng)度差異，一般為230個(gè)氨基酸。NS1蛋白有兩個(gè)核定位信 號(hào)（nuclear localization signal，lNSL），N末 端的35～41位是第一個(gè)核定位信號(hào)（NLS1），C末端203～237含有第二個(gè)核定位信號(hào)（NLS2），同時(shí)含有一個(gè)核仁定位信號(hào)。2009年甲型H1N1流感病毒NS1蛋白只有219個(gè)氨基酸，存在11個(gè)氨基酸的截短現(xiàn)象。為了研究這種截短現(xiàn)象是否影響其核仁定位情況，本試驗(yàn)利用表達(dá)不同長(zhǎng)度NS1（NS1-219、NS1-230、NS1-237）的3種重組流感病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞（A549），對(duì)其NS1蛋白的核仁定位情況進(jìn)行了研究，進(jìn)而探究NS1的截短是否對(duì)甲流的核仁定位有影響。

1 材料和方法

1.1 載體 細(xì)胞和病毒 PEGX-KG（以下簡(jiǎn)稱KG）載體購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；甲型H1N1流感病毒由武漢生物制品研究所提供；rPR8-甲（NS1-219）、rPR8-甲（NS1-230） 和rPR8-甲（NS1-237）為表達(dá)不同長(zhǎng)度NS1蛋白的重組流感病毒，是本實(shí)驗(yàn)室涂加鋼博士通過(guò)PCR定點(diǎn)突變的方法在甲型H1N1流感病毒的NS基因上讓終止密碼子后移，得到表達(dá)不同長(zhǎng)度NS1蛋白的基因片段，然后通過(guò)感染性克隆技術(shù)以毒株A/Puerto Rico/8/34 H1N1（PR8）為背景，替換甲型H1N1流感病毒的NS基因構(gòu)建重組病毒；大腸桿菌BL21和DH5α及A549細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；日本大白兔（體重約1.5 kg）購(gòu)自湖北省疾病防治與控制中心。

1.2 主要的試劑工具酶 各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、RNA-SOLV? Reagent RNA Isolation Solvent購(gòu)自O(shè)MEGA公司；UNIQ-10柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物（DL2000、DL15000）、One step RNA PCR kit（AMV）及高保真Taq酶primerstar購(gòu)自大連寶生物工程（TaKaRa）公司；酵母浸出粉及胰蛋白胨（Tryptone Soya Agar）購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自中山金橋；綠色熒光二抗購(gòu)自博士德生物工程有限公司；瓊脂粉購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)公司，日本進(jìn)口分裝；所需其他各種試劑、藥品均為分析純。

1.3 NS1基因的克隆 根據(jù)NCBI公布的2009年甲型H1N1流感病毒的NS基因序列設(shè)計(jì)引物。上游引物：5'-CGAATTCATGGACTCCAACACCATG-3'（引入EcoR I酶切位點(diǎn)）；下游引物：5'-CCGTCGACTCATTTCTGCTCTGGAGG-3'（引入SalI酶切位點(diǎn)）。首先將病毒在9日齡雞胚上增值并自尿囊液提取病毒RNA，利用通用引物U12（5'-AGCAAAAGCAGG-3'）反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增NS1基因。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s， 72℃延伸2.5 min，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)；最后 72℃再延伸10 min，然后降溫到16 ℃。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物各取5 μL，在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，剩余置4 ℃保存?zhèn)溆谩CR產(chǎn)物和載體經(jīng)EcoR I和SalI雙酶切，克隆至KG載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒KG-NS1，并進(jìn)行酶切、測(cè)序鑒定。

1.4 表達(dá)和純化NS1蛋白 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21中，并進(jìn)行酶切、測(cè)序鑒定。分別以1 mmol/L和0.1 mmol/L IPTG（16 ℃）誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。將NS1重組蛋白大量表達(dá)，采用GST柱親和層析純化。

1.5 NSI多克隆抗體的制備 以純化后的NS1蛋白為抗原免疫日本大白兔。采用頸部皮下多點(diǎn)注射的方法分3次免疫，每次免疫所用的抗原量分別為300、500、500 μg。初次免疫采用完全弗氏佐劑，二免和三免采用不完全弗氏佐劑，按照1:1與抗原混合，每次免疫間隔14 d。第三次免疫后14 d心臟采血，分離血清并用Western blot 檢測(cè)抗體。

1.6 表達(dá)不同長(zhǎng)度NS1蛋白的核仁定位 rPR8-Mex（NS1-219）、rPR8-Mex（NS1-230） 和 rPR8-Mex（NS1-237）三種重組流感病毒以3 MOI分別感染A549細(xì)胞，感染6 h后，用PBS洗3次；再以1%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次；加1%BSA 37℃封閉1 h，以200倍稀釋NS1多抗37℃孵育2 h，PBS洗3次然后用熒光二抗（抗兔）37℃孵育1 h，PBS洗3次，在奧林巴斯顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 NS1基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物為650 bp，與目的片段大小相符，說(shuō)明已成功擴(kuò)增NS1基因，如圖1所示。

圖1 NS1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of NS1 gene

2.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 將重組質(zhì)粒KG-NS1轉(zhuǎn)化到DH5α和BL21后搖菌提質(zhì)粒，產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和SalI雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳凝膠結(jié)果顯示，得到的兩個(gè)目的片段大小分別為650 bp和5000 bp，與預(yù)期相符，如圖2 所示，且測(cè)序也證明構(gòu)建成功。

圖2 重組KG-NS1載體的酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Recombinant vector digested with EcoRⅠand SalⅠ

2.3 目的蛋白的表達(dá)與純化 將菌體37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h后，分別加至終濃度為1 mmol/L和0.1 mmol/L IPTG，16 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜。SDS-PAGE結(jié)果顯示在IPTG終濃度為1 mmol/L的條件下目的蛋白在上清和沉淀中都有融合表達(dá)，大小為46 kDa（圖3），而在0.1 mmol/L IPTG和未誘導(dǎo)條件下均無(wú)此蛋白帶。以1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)目的蛋白，采用GST柱親和層析純化（圖4）。

圖3 NS1基因融合蛋白的SDS-PAGE結(jié)果分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression of NS1 fusion protein

圖4 純化以后的NS1蛋白Fig.4 Purif i ed NS1 protein

2.4 抗體的檢測(cè) 將純化后的蛋白跑SDS-PAGE并電轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜，將兔血清（一抗）37 ℃孵育1 h，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，37 ℃孵育1 h，DAB顯色（圖5）。

圖5 NS1基因融合蛋白Western blot檢測(cè)Fig.5 Western blot analysis of the expression of NS1 fusion protein

2.5 核仁定位rPR8-甲（NS1-219）、rPR8-甲（NS1-230）和rPR8-甲（NS1-237）三種重組流感病毒在A549細(xì)胞的定位，通過(guò)間接免疫熒光結(jié)果顯示都能定位于細(xì)胞核，但不能定位于核仁(圖6)。

圖6 rPR8-甲（NS1-219）、 rPR8-甲（NS1-230）和rPR8-甲（NS1-237）流感病毒的核定位Fig.6 The localizations of Inf l uenza virus rPR8-（NS1-219），rPR8-（NS1-230）and rPR8-（NS1-237）

3 討論

2009年甲型H1N1流感病毒能夠在人與人之間迅速傳播，并呈現(xiàn)暴發(fā)流行。NS1蛋白可能在其致病機(jī)制上發(fā)揮了重要作用。

流感病毒的NS1蛋白有兩個(gè)NSL，NS1在N末端的35～41位是第一個(gè)核定位信號(hào)（NLS1），C末端203～237位含有一個(gè)核定位信號(hào)（NLS2），同時(shí)也是一個(gè)核仁定位信號(hào)[7]。 核仁是細(xì)胞內(nèi)核糖體RNA加工與成熟的地方。核仁定位信號(hào)是病毒蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、編程性死亡的重要因素[8-10]。已經(jīng)證實(shí)流感病毒NS1蛋白的核仁定位抑制rRNA的合成[11]。Melen等[7]的研究表明流感病毒A/Udorn/72（H3N2）的NS1蛋白有237個(gè)氨基酸，能定位于核仁，缺失其C末端231～237位氨基酸后仍可以定位于核仁，但是缺失221～237位氨基酸就不能定位于核仁。2009年甲型H1N1流感病毒NS1蛋白只有219個(gè)氨基酸，存在11個(gè)氨基酸的截短現(xiàn)象。Hale等[12]對(duì)H1N1豬流感病毒NS1蛋白進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)從20世紀(jì)60年代中期分離的H1N1豬流感病毒都存在這樣的11個(gè)氨基酸的截短現(xiàn)象。那么這種自然存在的截短是不是H1N1豬流感病毒的一種進(jìn)化特征？我們猜想是否這種截短的NS1蛋白不能定位于核仁，而將其延伸到230或237個(gè)氨基酸時(shí)就能定位于核仁？因此本研究通過(guò)原核表達(dá)甲型H1N1流感病毒的NS1蛋白并制備多克隆抗體，利用本實(shí)驗(yàn)室涂加鋼博士通過(guò)感染性克隆技術(shù)構(gòu)建的表達(dá)不同長(zhǎng)度（219、230、237個(gè)氨基酸）NS1蛋白的重組流感病毒rPR8-甲（NS1-219）、rPR8-甲（NS1-230）和rPR8-甲（NS1-237）進(jìn)行核仁定位研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種重組病毒都不能定位于核仁。Melen等[7]的進(jìn)一步研究證明，只要在C末端的224和229位分別為精氨酸（R）和賴氨酸（K），就可以定位于核仁。而2009年的甲型H1N1流感病毒在224和229位分別是精氨酸（R）和谷氨酸（E），不是堿性氨基酸R和K[7]。如果甲型H1N1流感病毒在224和229位分別為精氨酸（R）和賴氨酸（K），其NS1蛋白是否可以核仁定位還有待于進(jìn)一步研究。

總之，了解2009年甲型H1N1流感病毒的NS1蛋白核仁定位情況，將有助于我們進(jìn)一步了解甲型H1N1流感病毒的復(fù)制和傳播機(jī)制以及其毒力和致病機(jī)理。

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