提金鳳，李志杰，王海燕，吳衛(wèi)東

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，濰坊 261061；2.山東省壽光市圣城畜牧獸醫(yī)管理站，壽光 262700；3.山東省菏澤市畜牧局，菏澤 274000）

鴨病毒性肝炎（duck viral hepatitis，DVH）是由鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）引起的一種傳播快速、急性高度致死性傳染病，主要侵害1月齡以內(nèi)的雛鴨。該病于1949年由Levine和Hofstad首次發(fā)現(xiàn)于美國的長島，現(xiàn)已呈全世界性分布，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一[1,2]。

傳統(tǒng)上鴨病毒性肝炎的血清型可分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3個(gè)血清型，隨著近幾年新型鴨病毒性肝炎的出現(xiàn)，傳統(tǒng)的血清分型已經(jīng)不再適用[3]。目前，對(duì)鴨病毒性肝炎的分型有了新的標(biāo)準(zhǔn)，傳統(tǒng)上的血清Ⅱ型、Ⅲ型鴨肝炎病毒被劃為了星狀病毒，不再屬于鴨肝炎病毒。

根據(jù)近年來鴨病毒性肝炎的發(fā)病特點(diǎn)，鴨肝炎病毒被劃分為 3個(gè)基因型，分別是基因A型（傳統(tǒng)血清Ⅰ型）、B型（臺(tái)灣新型）、C型（韓國新型）。3個(gè)基因型的病毒幾乎沒有抗原交叉性[4,5]。鴨肝炎病毒有VP0、VP1和VP3三種功能性結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP1由238 個(gè)氨基酸組成，其分子量為26.6 kDa。VP1 蛋白（外殼蛋白）作為主要的宿主保護(hù)蛋白，編碼主要的抗原位點(diǎn)并具有型特異性中和位點(diǎn)[6，7]，主要刺激機(jī)體產(chǎn)生具有中和性的抗體。

目前，臨床上對(duì)DVH的治療主要是采用卵黃抗體，但有時(shí)受卵黃抗體中非特異性蛋白或抗體滴度過低的影響，治療效果較差。針對(duì)這種情況，本研究從山東省分離出一株Ⅰ型（基因A型）DHV，然后對(duì)其進(jìn)行單克隆抗體的研制，用VP1的原核表達(dá)蛋白作為篩選抗原，篩選出了具有中和性的單克隆抗體，為今后進(jìn)一步用該單抗來診斷和治療鴨病毒性肝炎提供了重要生物制劑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 雞胚、細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞胚購自山東家禽所；6周齡的BALB/c小鼠以及8～10周齡的昆明鼠購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院；小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14由農(nóng)業(yè)部青島動(dòng)檢所邵衛(wèi)星博士饋贈(zèng)。

1.1.2主要試劑 PEG4000、高糖型DMEM、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、L-谷氨酰胺購自Sigma公司；羊抗鼠IgG-HRP、羊抗鼠IgM-HRP購自華美公司；單克隆抗體亞類鑒定試劑盒、鄰苯二胺（OPD）、辣根過氧化物酶（HRP）氨基喋呤購自GIBCO BRL公司。

1.2 方法

1.2.1免疫原的制備及鑒定 將已經(jīng)鑒定的Ⅰ型DHV接種100枚9～11日齡的SPF雞胚，收集72～96 h死亡雞胚的尿囊液，并將收集的尿囊液進(jìn)行濃縮純化。方法如下：先將尿囊液4℃ 13 000×g離心10 min，取上清液，將上清液與等量的氯仿震蕩混勻，在4 ℃ 以8000×g離心 10 min，取上清水相。然后將水相放在透析袋中4℃透析，透析液為50%的PEG4000[9]。將透析后的濃縮液在4 ℃ 13 000×g離心10 min，取上清液，分光光度計(jì)測(cè)定DHV的濃度。將純化后的抗原經(jīng)0.22 μm濾器過濾后接種9～11日齡的雞胚，并設(shè)正常雞胚作對(duì)照。記錄雞胚死亡及胚體病變情況。

1.2.2 檢測(cè)抗原的制備及鑒定

1.2.2.1 原核重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 參考GeneBank中已發(fā)布的血清型Ⅰ型DHV VP1基因序列，參照文獻(xiàn)[10,11]由大連寶生物公司合成引物。上游引物：5' -GAATTCGGTGATTCCAACAGTTG -3'；下游引物：5'-GCGGCCGCTTCAATTTCCAGATTG-3'。劃線處分別為限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ的識(shí)別位點(diǎn)[8,9]。RT-PCR擴(kuò)增VP1基因并回收純化。以EcoRⅠ和NotⅠ對(duì)純化的RT-PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒載體pET-30(a+)分別進(jìn)行雙酶切并回收純化，然后按照3:1的比例（RT-PCR產(chǎn)物:pET-30(a+)）將兩者混合，加T4 DNA連接酶，16 ℃反應(yīng)8 h進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含卡那霉素的瓊脂平板上篩選，挑取陽性克隆并擴(kuò)增，小量提取質(zhì)粒后，經(jīng)PCR擴(kuò)增、1%瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序鑒定。陽性質(zhì)粒命名為pET-VP-1[12]。

1.2.2.2 融合蛋白的表達(dá)及鑒定 將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-VP-1和空載體pET-30a(+)分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。挑取菌落，在LB（Kan+）中培養(yǎng)13 h，取50 μL菌液至5 mL LB（Kan+）中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.1 mmoL/L的IPTG。誘導(dǎo)4 h后，各取l mL的菌液，PBS洗滌3次，每次13 000×g離心5 min。將洗滌產(chǎn)物用50 μL的PBS懸浮，分別加入50 μL的2倍上樣緩沖液，煮沸3～5 min后，各取15 μL的上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。SDSPAGE電泳方法參照分子克隆(第二版)。

1.2.2.3 篩選抗原的制備 根據(jù)1.2.3.3中的方法，誘導(dǎo)5 L菌液。超聲波裂解細(xì)菌，13 000×g離心10 min，將所得沉淀用相同體積的PBS溶解。分別取離心后的上清和沉淀5 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳。然后將沉淀用PBS離心洗滌5～6次，每次13 000×g離心5 min，將洗滌后的沉淀SDSPAGE電泳鑒定后作為單克隆抗體的篩選抗原。

1.2.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立[13]

1.2.3.1 免疫動(dòng)物 取6周齡的BALB/c小鼠，腹部皮下注射已濃縮純化后的DHV，100μg/只，每隔2周免疫1次，第3次免疫后1周，眶下竇采血，用間接ELISA測(cè)定小鼠血清的OD值，若為陽性，1周后加強(qiáng)免疫1次，3d后融合。

1.2.3.2融合 按照參考文獻(xiàn)[14]方法，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞按3:1的比例，用PEG4000融合。采用間接ELISA法進(jìn)行篩選，將檢測(cè)為陽性孔中的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，及時(shí)凍存，同時(shí)按照有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，至陽性率為100%，并制備腹水。

1.2.4 單克隆抗體特性的鑒定

1.2.4.1 亞類鑒定 用亞類鑒定試劑盒，采用抗原介導(dǎo)的ELISA法（Atigen-Mediated ELISA），按其說明書所介紹的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.2 效價(jià)測(cè)定 取已定株的雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清和其腹水做倍比稀釋，間接ELISA進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.3 單克隆抗體特異性鑒定 用雞胚尿囊液、鴨瘟病毒（Duck plague virus, DPV）、減蛋綜合征病毒（Eggdrop syndrome virus, EDSV）、傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus IBV）、馬立克式病毒（Marek's disease virus，MDV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）和基因C型DHV等抗原點(diǎn)樣，用Dot- ELISA檢測(cè)所制備的單克隆抗體的反應(yīng)性。

1.2.4.4 雞胚中和特性測(cè)定 采用固定病毒-稀釋單抗法進(jìn)中和特性鑒定。用滅菌生理鹽水稀釋已鑒定的DHV尿囊液，稀釋至0.2 mL病毒含量為200ELD50。取0.2 mL與等量的1:5 、1:10和1:50稀釋的單抗進(jìn)行混合，37 ℃水浴作用30 min，然后接種SPF雞胚，每個(gè)稀釋度接種4枚雞胚，37 ℃溫箱培養(yǎng)，觀察5～8 d。另設(shè)生理鹽水空白對(duì)照和病毒對(duì)照組。然后將單抗分別與本實(shí)驗(yàn)室已分離鑒定的7株Ⅰ型DHV（其中3株分離自濰坊市、4株分離自濟(jì)南市）進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4.5 利用Western blot進(jìn)行鑒定 取處理好的樣品（分別含空載體pET-30a（+）和重組質(zhì)粒pETVP-1）進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，按文獻(xiàn)[6]方法將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素薄膜（NC膜）上，10%小牛血清封閉后，依次加入細(xì)胞上清，羊抗鼠的二抗，最后DAB避光顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 免疫原的制備及鑒定 將濃縮純化后的Ⅰ型DHV經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度，濃度為 5 mg/mL。將純化后的抗原經(jīng)0.22μm濾器過濾后接種9～11日齡的雞胚，并設(shè)正常雞胚作對(duì)照。雞胚在72～96 h之間死亡，死亡的胚體水腫出血，肝臟上有白色壞死點(diǎn)，沒有接種抗原的對(duì)照組雞胚發(fā)育正常。

2.2 檢測(cè)抗原的制備及鑒定

2.2.1原核重組質(zhì)粒pET-VP-1構(gòu)建及鑒定 RTPCR進(jìn)行Ⅰ型DHV VP1基因擴(kuò)增，獲得714 bp大小的基因片段（圖1）。以重組質(zhì)粒pET-VP-1為目的模板，用DHV VP1基因的特異性上下游引物進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果顯示1條714 bp左右的條帶。

圖1 I型DHV VP1基因的RT-PCR產(chǎn)物Fig.1 Identif i cation of DHV VP1 with RT-PCR amplication

2.2.2 表達(dá)產(chǎn)物VP1蛋白的鑒定、制備及純化 經(jīng)PCR鑒定，原核重組質(zhì)粒pET-VP-1構(gòu)建成功。VP1經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，在26.6 kDa處出現(xiàn)目的條帶，與理論值相符，說明重組質(zhì)粒pET-VP-1成功表達(dá)VP1蛋白（圖2），該蛋白以包涵體的形式表達(dá)。

圖2 DHV VP1基因原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定Fig.2 Identif i cation of DHV VP1 prokaryotic expressed product with SDS-PAGE

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立 用間接ELISA方法，獲得了1株針對(duì)Ⅰ型DHV的單抗雜交瘤細(xì)胞株，命名為2B6。傳代培養(yǎng)后，依然能穩(wěn)定分泌單抗。

2.4 單克隆抗體特性的鑒定

2.4.1利用含空載體pET-30a（+）菌體進(jìn)行鑒定的結(jié)果 通過方陣實(shí)驗(yàn)及蛋白濃度的測(cè)定確定pET-30a（+）菌體蛋白的包板濃度，經(jīng)檢測(cè)，該株雜交瘤2B6的細(xì)胞上清與其反應(yīng)均呈現(xiàn)陰性。

2.4.2 單克隆抗體的部分生物學(xué)特性 單抗的亞類鑒定及細(xì)胞上清、腹水的ELISA效價(jià)見表1。

表1 1株單抗的部分生物學(xué)特性Table 1 Biological character of one monoclonal antibody

2.4.3 單抗特異性及廣譜性鑒定 所獲得的單抗與雞胚尿囊液、DPV、EDS-76V、IBV、MDV、NDV及C-DHV等均不反應(yīng)，特異性好。該單抗與本實(shí)試驗(yàn)分離的7株Ⅰ型DHV均反應(yīng)，具有一定的廣譜性，見表2。

表2 單抗2B6細(xì)胞上清與DHV的Dot- ELISA反應(yīng)結(jié)果Table 2 Result of Dot- ELISA between the monoclonal antibody 2B6 and DHV

2.4.4 中和特性鑒定 本實(shí)驗(yàn)所獲得的單抗中和特性較好，能以該雜交瘤細(xì)胞上清的原倍中和雞胚，并且和本實(shí)驗(yàn)分離的其它7株Ⅰ型DHV均能發(fā)生中和反應(yīng)，廣譜性較好。這和陳溥言、楊萍萍等所報(bào)道的單抗特性不一致。

2.4.5 利用Western blot鑒定結(jié)果 經(jīng)Western blot鑒定，在含重組質(zhì)粒pET-VP-1的菌液的泳道，該株單抗2B6在26.6 kDa處出現(xiàn)1條清晰的條帶，而在含空載體pET-30a（+）的菌液的泳道，沒有出現(xiàn)任何條帶（圖3）。故該單抗2B6是針對(duì)DHV VP1蛋白的抗體。

圖3 McAb 特異性的Western blot分析Fig.3 Specif i city identif i cation of McAb by Western blot

3 討論

3.1 通過雞胚分離培養(yǎng)和各種鑒定，本研究獲得了一株Ⅰ型DHV。

3.2 國內(nèi)抗鴨肝炎病毒單抗的制備由陳溥言等首先報(bào)道，之后楊萍萍等進(jìn)行了相關(guān)研究[12]，但兩者所制備的DHV單抗中和特性都很差，限制了該單抗的應(yīng)用[12]。本研究旨在利用純化后的病毒免疫小白鼠，用DHV VP1基因的原核表達(dá)蛋白作為篩選抗原（因?yàn)镈HV VP1蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生具有中和的抗體，這樣大大的增加了獲得具有中和性單抗的概率），制備出了一株具有中和特性的針對(duì)VP1蛋白的Ⅰ型DHV單抗。

3.3 本研究獲得了一株雜交瘤細(xì)胞株2B6，該雜交瘤株細(xì)胞上清原液能中和病毒，具有較好的中和特性，且與本試驗(yàn)分離的其它7株Ⅰ型DHV均能發(fā)生中和反應(yīng)，廣譜性較好。該株雜交瘤的穩(wěn)定性和特異性較好，為該單抗應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室對(duì)Ⅰ型DHV檢測(cè)、DHV病毒檢測(cè)試劑盒的制備以及對(duì)DVH的抗病毒治療等提供了重要的生物試劑。

[1] Tseng C H, Tsai H J.Molecular characterization of a new sero-type of duck hepatitis virus [ J ].Virus Res, 2007,126(2) : 19-31.

[2] 馬秀麗, 趙立娜, 夏雪梅, 等.一株韓國新型DHV的分離及RT-PCR鑒定[J ].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 22 (5):596～598.

[3] 范書才, 李虹, 袁率珍, 等.新型鴨肝炎病毒的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2009, 31(10): 770-775.

[4] 王麗艷, 付余, 潘夢(mèng), 等.鴨肝炎病毒的基因分型[C]//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十四次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.2008, 171-172.

[5] 武永杰.Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1基因的克隆及其結(jié)構(gòu)蛋白的生物學(xué)特性預(yù)測(cè)[D].福建: 福建農(nóng)林大學(xué), 2008.

[6] Tseng C H, Knowles N J, Tsai H J.Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus [J].Virus Res, 2007, 123(2): 190-203.

[7] 施少華, 蘇敬良, 黃瑜, 等.鴨肝炎病毒新血清型基因組序列分析[J].微生物學(xué)報(bào), 2009, 49(3)：309-315.

[8] Purchase H G.禽病原分離鑒定實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)[M].3版, 唐桂運(yùn), 武華,譯.冀錫霖審校.北京:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1993, 10: 190- 194.

[9] 楊萍萍, 宋敏訓(xùn), 艾武, 等.鴨肝炎病毒單克隆抗體的研制[J ].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2006, 28(2): 212-215.

[10] 馬秀麗, 宋敏訓(xùn), 于可響.鴨病毒性肝炎病毒VP1基因表達(dá)及其抗體檢測(cè)[J ].微生物學(xué)報(bào), 2008, 48(8):1110-1114.

[11] 甘一迪, 劉家森, 姜騫.3株鴨肝炎病毒Ⅰ型結(jié)構(gòu)基因VP1的克隆及序列分析[J ].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2009, 40 (6) :952-957.

[12] 提金鳳, 張艷梅, 郝貴杰, 等.雞白細(xì)胞介素2原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定[J ].中國家禽, 2005,27(14): 15-17.

[13] 提金鳳, 張艷梅, 李志杰, 等.用DNA免疫研制雞白細(xì)胞介素2單克隆抗體[J ].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007,29(7): 537-540.

[14] 劉秀梵.單克隆抗體在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用[M].合肥: 安徽科學(xué)技術(shù)出版社, 1994.

[15] 提金鳳, 李志杰, 李舫, 等.山東地區(qū)Ⅰ型鴨肝炎病毒分離鑒定及單克隆抗體的研制[J ].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012,33(2): 63-66.