馮曉勤 劉元春

近年來，對骨髓間充質干細胞（MSC）的研究初步顯示，其能促進造血干細胞移植后的供者細胞植入及抑制移植物抗宿主?。℅raft Versus Host Disease， GVHD）的發(fā)生。但骨髓間充質干細胞對上述作用的免疫調控機制尚有待于進一步研究。基礎研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GVHD的發(fā)生、發(fā)展與淋巴細胞趨化因子受體存在著相關性，本實驗擬通過研究MSC對小鼠T淋巴細胞亞群增殖后表達趨化因子受體的變化，來更深入地了解MSC的免疫調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8～12周齡的雄性C57BL/6小鼠，重量180～220 g，清潔級。由南方醫(yī)科大學實驗動物中心引進，南方醫(yī)科大學動物中心無菌層流倉飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器設備 LG-DMEM （美國，Gibco），植物血凝素PHA（美國，Sigma），小鼠CD3-CY-5單抗、小鼠CD4-FITC單抗、小鼠CD8-FITC單抗、小鼠CCR7-PE單抗、小鼠CCR5 -PE單抗、小鼠CXCR3-PE單抗（美國，ebioscience）。流式細胞儀（美國，F(xiàn)ACScan，BD）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)和分離 C57BL/6小鼠（8～12周齡）頸椎脫臼處死后置酒精中浸泡10 min，無菌條件下取小鼠雙側股骨及脛骨，無菌層流操作臺上用注射器吸取含50μl/ml慶大霉素LG-DMEM培養(yǎng)液沖洗小鼠股、脛骨干骺端，分別采用4、7號針頭抽吸含骨髓細胞的培養(yǎng)液，制成單細胞懸液，用含10%胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，調整細胞密度為2×105/cm2。5%CO2，37 ℃飽和濕度培養(yǎng)，每24～36小時后去除懸浮細胞，每3～4天全量換液。待細胞融合達70%～80%后，0.25%胰蛋白酶EDTA消化，收集細胞傳代培養(yǎng)，取3～8代細胞用于實驗研究。

1.2.2 淋巴細胞增殖試驗及實驗分組 C57BL/6小鼠（8～12周齡）頸椎脫臼處死后置酒精中浸泡10 min，無菌條件下取脾臟置于PBS溶液中，剪切脾臟，200目鋼篩過濾制成單細胞懸液，加入紅細胞裂解液2 ml孵育2 min，PBS離心洗滌，24孔培養(yǎng)板每孔加入1×106細胞數(shù)，每孔含植物血凝素20 μg/ml。試驗分組：A組按10%比例混合培養(yǎng)小鼠間充質干細胞及脾細胞；B組按1%比例混合培養(yǎng)MSC及脾細胞；C組為單純小鼠脾細胞作為對照組，于37℃，5%CO2孵育3 d后檢測小鼠淋巴細胞各亞群中趨化因子CXCR3、CCR5及CCR7的表達。

1.2.3 流式細胞術檢測趨化因子受體表達 每培養(yǎng)孔各取細胞2×105個，采用三色熒光標記法分別標記CD3、CD4、CD8及小鼠趨化因子受體CXCR3、CCR5、CCR7單克隆抗體。在流式細胞儀上經(jīng)CellQuest軟件獲取細胞并分析CD3+CD8+及CD3+CD4+細胞亞群表達趨化因子的百分率。

1.3 統(tǒng)計學處理 采集數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件包及Exce 17.0分析統(tǒng)計軟件處理。多組之間均數(shù)比較采用方差分析，多組均數(shù)間的多重比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

在CD3+CD8+亞群中，添加了骨髓間充質干細胞的兩個培養(yǎng)組（10%MSC組及1%MSC組）均較對照組增高表達CXCR3及CCR7（P<0.05），而CCR5僅在10%MSC的高濃度組較對照組有增高表達。在CD3+CD4+亞群中，CXCR3的表達在10%MSC組、1%MSC組及對照組表達差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；CCR5及CCR7在添加了骨髓間充質干細胞的兩個培養(yǎng)組均較對照組增高表達，且在該兩種骨髓間充質干細胞濃度梯度中呈劑量依賴性，見表1、2。

表1 MSC對小鼠CD3+CD8+淋巴細胞亞群表達趨化因子受體的影響（±s） %

*P<0.05，△P<0.01，與C組比較；#與B組比較，P<0.01

分組 CD3+CD8+CXCR3+ CD3+CD8+CCR5+ CD3+ CD8+CCR7+A組[MSC +脾細胞 （10%MSC）]17.81±2.90*7.40±2.53*7.59±1.08△#B組[MSC +脾細胞 （1%MSC）]13.84±7.31* 12.61±5.00 10.60±2.55△C組[脾細胞 （對照組）]3.71±0.401.23±0.330.93±0.24 F 值 7.68 12.44 28.50 P 值 <0.05 <0.05 <0.05

表2 MSC對小鼠CD3+CD4+淋巴細胞亞群表達趨化因子受體的影響（-x±s） %

3 討論

趨化因子受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，在細胞的增殖、遷移、炎癥反應等生理功能及病理機制中發(fā)揮重要作用，趨化因子受體在趨化因子的作用下，通過激活選擇素/整合素等粘附分子，誘導白細胞的粘附、穿透血管內膜及向特定部位的遷徙。其中T淋巴細胞能對多種趨化因子發(fā)生反應[1]。

骨髓間充質干細胞（Mesenchymal stem cell，MSC）是目前倍受關注的一類具有多向分化潛能和高度自我更新能力的組織干細胞[2]，此外骨髓間充質干細胞表面還表達多種黏附分子及趨化因子，具有促進造血干細胞歸巢的作用，在體外支持造血干細胞擴增，臨床多項研究顯示MSC能促進造血干細胞植入[3]，且可抑制移植物抗宿主病（GVHD），因此MSC已被FDA批準用于臨床造血干細胞移植。

2002年第1例MSC用于半相合造血干細胞移植未發(fā)生嚴重GVHD[4]；Ning H.及來自歐洲外周血及骨髓移植多中心Ⅱ期臨床研究顯示MSC對HLA不全相合造血干細胞移植后并發(fā)的嚴重或難治性移植物抗宿主病顯示出較好的預防及治療效果[5-6]。Ikehara S教授把骨髓和股骨在小鼠身上進行移植，移植后發(fā)現(xiàn)在胸腺中可以找到供者的骨髓間充質干細胞，表明骨髓間充質干細胞可以移行到胸腺，并且參與胸腺細胞的陽性選擇[7]。骨髓間充質干細胞移行至胸腺及T細胞表達趨化因子受體上調，有利于供者T細胞移行至胸腺進行馴化及選擇，可能是骨髓間充質干細胞抑制GVHD的原因之一。

由于趨化因子受體本身可能參與GVHD的發(fā)生及發(fā)展[8-9]，MSC抑制GVHD的作用是否與MSC對趨化因子受體的免疫調控有關，是否與不同細胞亞群對趨化因子表達譜不同有關，在本試驗中，骨髓間充質干細胞能上調T淋巴細胞CD3+CD+8亞群表達趨化因子受體CCR5、CCR7、CXCR3；同時促進CD3+CD4+亞群表達CCR5、CCR7，而且在CD3+CD4+亞群中的上調表達呈MSC劑量依賴性。提示骨髓間充質干細胞可能提高T細胞的趨化能力，有利于促使淋巴細胞在趨化因子的作用下移行和歸巢到趨化因子表達較高的骨髓和外周造血器官如胸腺、淋巴結、脾臟和肝臟，但其對GVHD發(fā)生發(fā)展的實際影響，有待于進一步研究。

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