龔令旗

湖南省益陽(yáng)市資陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，湖南益陽(yáng)413001

霍亂是由一群和Ο139群霍亂弧菌引起以腹瀉為主要癥狀的甲類傳染病，在我國(guó)尤其是近幾年來(lái)因食用海水產(chǎn)品引起霍亂弧菌感染的事件逐年升高。為了查明霍亂疫情發(fā)生的原因，以及傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法和膠體金快速免疫層析法的比較，2010年10月該市某村也發(fā)生一起因食用甲魚引起感染的霍亂疫情，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)，證實(shí)是由霍亂弧菌Ο139群感染引起的，現(xiàn)將其病原學(xué)檢測(cè)情況報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患者腹瀉物、家屬和部分聚餐人員的肛拭子共計(jì)33份，病家水缸水、井水以及患者購(gòu)買甲魚的徐記水產(chǎn)品批發(fā)部處的甲魚、牛娃等海水產(chǎn)品及甲魚暫時(shí)養(yǎng)殖水共計(jì)25份。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備，檢測(cè)試劑及培養(yǎng)基

堿性蛋白胨，慶大霉素瓊指，微量生化鑒定管均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司，霍亂弧菌Ο1群和Ο139群血清購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，霍亂弧菌Ο1群和Ο139群膠體金快速檢測(cè)條購(gòu)自北京莊笛浩禾生物有限公司。所有試劑及培養(yǎng)基均在有效期內(nèi)使用，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)均符合要求。

1.3 方法

1.3.1 膠體金快速免疫層析試驗(yàn)法 將霍亂弧菌Ο139群和Ο1群膠體金快速檢測(cè)條放置于潔凈干燥工作臺(tái)上，用吸管取患者腹瀉物，密切接觸者扛拭子增菌液以及相關(guān)甲魚的一二次增菌液各2～3滴，滴入檢測(cè)條加樣端15 min內(nèi)觀察結(jié)果。

1.3.2 常規(guī)菌株分離 按《霍亂防治手冊(cè)》（5版）進(jìn)行[1]患者腹瀉物、可疑者肛拭子直接接種10 mL堿性蛋白胨水中增菌6～8 h后，劃線接種慶大霉素瓊脂平板，井水和甲魚養(yǎng)殖水標(biāo)本450 mL，調(diào)pH9.0加50 mL 10倍濃縮堿性胨水，以無(wú)菌方式采集甲魚內(nèi)臟25 g接種225 mL堿性胨水，增菌6～8 h，劃線接種慶大霉素瓊脂平板分純培養(yǎng)，同時(shí)取0.1～0.2 mL表層培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種10 mL堿性胨水作二次增菌后劃線接種慶大霉素瓊脂（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，挑取可凝菌落染色鏡檢。同時(shí)挑取慶大霉素瓊脂上中等大小露水狀半透明灰色菌落與Ο1群和Ο139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗(yàn)，用生理鹽水作對(duì)照。同時(shí)分純菌落做生化反應(yīng)鑒定，并將所分離的陽(yáng)性菌株送省級(jí)疾控中心進(jìn)行相關(guān)毒力基因的鑒定以確定其型別。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果

所有內(nèi)外環(huán)境標(biāo)本Ο1群霍亂弧菌膠體金快速試紙條結(jié)果全部陰性，除患者腹瀉物，1名密切接觸者徐記水產(chǎn)品批發(fā)處的甲魚內(nèi)臟及該甲魚的養(yǎng)殖水的第二次增菌液等4份標(biāo)本為Ο139群霍亂弧菌膠體金試紙條結(jié)果陽(yáng)性外，其余均為陰性，見(jiàn)表1。

表14 株Ο139群霍亂弧菌檢測(cè)結(jié)果

2.2 常規(guī)法分離菌株的檢測(cè)結(jié)果

33份內(nèi)環(huán)境標(biāo)本中從患者腹瀉物和密切接觸者中分離出2株Ο139群霍亂弧菌，25份外環(huán)境標(biāo)本中甲魚內(nèi)臟及該甲魚養(yǎng)殖水分離出2株Ο139群霍亂弧菌，4株Ο139群霍亂弧菌陽(yáng)性菌株均分解葡萄糖，麥芽糖，甘露醇，蔗糖，不分解阿拉伯糖，乳糖，賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性，精氨酸脫羧酶陰性，氧化酶陽(yáng)性，粘絲試驗(yàn)陽(yáng)性，有動(dòng)力，0%氯化鈉生長(zhǎng)、6%氯化鈉生長(zhǎng)，10%氯化鈉不生長(zhǎng)，不產(chǎn)生硫化氫。送省級(jí)疾控中心的4株陽(yáng)性菌株通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行霍亂弧菌毒力基因的檢測(cè)，結(jié)果霍亂弧菌毒力基因ctxA、zot.ace均為陽(yáng)性，說(shuō)明其屬同一型別。4株Ο139群霍亂弧菌檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表1。

3 討論

霍亂弧菌可通過(guò)水、食物、生活接觸和蒼蠅等途徑傳播。本次疫情經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)分析，確定為一起食用甲魚引起的霍亂弧菌Ο139群感染。依據(jù)：本次霍亂弧菌陽(yáng)性甲魚標(biāo)本來(lái)自患者購(gòu)買的同一批發(fā)處，通過(guò)對(duì)患者，甲魚及甲魚養(yǎng)殖水分離出來(lái)的陽(yáng)性菌株進(jìn)行PCR毒力基因檢測(cè)，結(jié)果四株陽(yáng)性菌株均為具有同一毒力基因的產(chǎn)毒株[2]。

當(dāng)前隨著人們生活水平的提高，因聚餐食用海水產(chǎn)品引起霍亂疫情的事件不斷增加[4]，因此建立快速，準(zhǔn)確檢測(cè)病原菌感染的檢測(cè)方法是有效控制疫情蔓延的重要手段。目前，霍亂弧菌病原菌感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是菌株的成功分離，通過(guò)增菌、分離培養(yǎng)及血清學(xué)生化鑒定等一系列步聚來(lái)完成，但靈敏度低，操作較繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，不適合基層醫(yī)療單位采用；而膠體金快速檢測(cè)法靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，可作為最基層醫(yī)療單位的篩查，可以快速提供篩查報(bào)告，為控制疫情蔓延爭(zhēng)取時(shí)間，但其容易失效，穩(wěn)定性稍差，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[3]，且拿不到菌株。因此在發(fā)生疫情的病原學(xué)診斷時(shí)，為預(yù)防漏檢和縮短時(shí)間，筆者建議兩種方法同時(shí)采用。另外在本次試驗(yàn)中，密切接觸者的肛拭子第一次增菌培養(yǎng)物膠體金法快速檢測(cè)霍亂弧菌Ο139群為弱陽(yáng)性，可能與其含有的菌量過(guò)少有關(guān)，為慎重起見(jiàn)，研究對(duì)其進(jìn)行兩次增菌后進(jìn)行分離培養(yǎng)。而在甲魚養(yǎng)殖水的第一次增菌后用常規(guī)細(xì)菌分離未檢出陽(yáng)性菌株，第二次增菌后才檢出陽(yáng)性菌株，這可能與其甲魚的換水消毒導(dǎo)致菌量過(guò)少有關(guān)。為提高檢出率，建議今后的監(jiān)測(cè)中應(yīng)進(jìn)行二次增菌，且每個(gè)平板至少挑取5個(gè)菌落進(jìn)行玻片凝集。

為預(yù)防進(jìn)食甲魚引起的霍亂發(fā)病，各級(jí)衛(wèi)生部門應(yīng)加強(qiáng)海水產(chǎn)品衛(wèi)生管理措施[4]，同時(shí)也應(yīng)加大衛(wèi)生宣傳力度，特別是在經(jīng)濟(jì)條件和衛(wèi)生條件較差的農(nóng)村，加工甲魚時(shí)一定要生熟分開(kāi)，甲魚要煮熟煮透后食用。

[1] 衛(wèi)生部衛(wèi)生防疫司.霍亂防治手冊(cè)菌[M].5版.北京:衛(wèi)生部疾病控制司,1999.

[2] 鄭向梅,呂均.兩株霍亂弧菌同源性分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2010,37(23):4508.

[3] 王瓊妹,周登仁,徐海英,等.膠體金法應(yīng)用于外環(huán)境標(biāo)本中霍亂弧菌的檢測(cè)[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2010(11):1374-1375.

[4] 曹衛(wèi)中,陸春香,蔡藕菊,等.崇明縣海水產(chǎn)品霍亂弧菌污染狀況調(diào)查[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(9):1725-1726.