劉 帥，朱明鯤，劉 旭，李 玲

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510631)

ABF是一類AREB類轉(zhuǎn)錄因子，可以與ABA誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)［1］．2000 年，UNO 等［2］和 CHOI等［3］分別從擬南芥中分離出4種bZIP蛋白，其中ABF1主要參與低溫、ABA脅迫的應(yīng)答反應(yīng);ABF3主要受 ABA、高鹽、低溫、熱、氧化脅迫誘導(dǎo);ABF2/AREB1、ABF4/AREB2則主要參與ABA、干旱、高鹽、熱和氧化脅迫應(yīng)答反應(yīng)［2］．AREBs轉(zhuǎn)錄因子特異存在于植物中，超表達(dá)和abf4突變體植株，分析它們對(duì)ABA和鹽脅迫響應(yīng)特點(diǎn)，揭示ABF3和ABF4的功能差異，為深入研究ABF在ABA信號(hào)途徑的作用提供依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 材料與處理

哥倫比亞生態(tài)型野生型擬南芥(Columbia，縮寫為Col)．?dāng)M南芥突變體abf3(SALK 127755)和abf4(SALK 069523)購(gòu)于擬南芥資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室純化鑒定．

ABA處理:種子消毒后，播種于含有不同濃度的ABA的1/2MS固體培養(yǎng)基上，4℃放置2 d，然后在光照培養(yǎng)箱中(晝夜溫度為22°/20°，光照周期為16 h/8 h，平均濕度為40% ～60%)培養(yǎng)．

鹽脅迫處理:種子播種于含有 0、100、200 mmol/L NaCl的1/2MS固體培養(yǎng)基上，4℃同步化處理2 d，然后光照培養(yǎng)箱中(晝夜溫度為22°/20°，光照周期為16 h/8 h，平均濕度為40% ～60%)培養(yǎng)．

1．2 試驗(yàn)試劑及PCR引物

Taq DNA聚合酶、RNA提取試劑TRizol、DNase I(RNAase-free)、One Step RT-PCR試劑盒均購(gòu)自TaKaRa;引物合成和PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海英俊公司完成，名稱及序列如下:2Bd3-LP(ABF4)5’-GGGTTTTAGGGCTTGGATGCT-3’，2Bd3-R(ABF)5’-TTCACAGGCGCAGAAAATGCT-3’，ABF3-F 5’-TTGATGGTGTGAGTGAGCAGC-3’，ABF3-R 5’-TGGCAAGAGTTGGACGTTGTG-3’，LBa1 5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’;其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純．

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 RT-PCR檢測(cè) 按照 TaKaRa提供的 TR-izol使用方法提取南芥葉片RNA備用，使用one step RT-PCR對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行基因表達(dá)鑒定．程序:50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃終止反應(yīng)2 min，94℃變性2 min，94℃變性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸70 s，28個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min．質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物．

1．3．2 種子萌發(fā)率 種子經(jīng)春比后，在光照條件下培養(yǎng)1 d后，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，每12 h統(tǒng)計(jì)1次，重復(fù)3次．

1．3．3 綠胚率統(tǒng)計(jì) 種子經(jīng)光照培養(yǎng)16 d統(tǒng)計(jì)綠胚率，重復(fù)3次．

1．3．4 根長(zhǎng)比率 擬南芥在1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)至長(zhǎng)出2片子葉(約3 d)，點(diǎn)種在1/2MS固體培養(yǎng)基正常板和含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0．8%蔗糖的1/2MS固體培養(yǎng)基上，平板垂直培養(yǎng)8 d，測(cè)量主根長(zhǎng)度．

1．3．5 氣孔開度和開度率測(cè)定 3周齡葉片置于氣孔開度溶液(KCl 50 mmol/L，CaCl250 μmol/L，MES 10mmol/L，pH 6．15)0．5 h，撕下葉片表皮立即放入固定液(V(無(wú)水乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)中為對(duì)照葉片．處理葉片置于含10μmol/L ABA的氣孔處理溶液1 h后固定，顯微鏡下拍照記錄結(jié)果．

1．3．6 葉綠素含量測(cè)定 參照李合生等［4］的方法測(cè)定和計(jì)算葉綠素含量，單位為mg/g．

1．3．7 葉片黃化率統(tǒng)計(jì) 植株鹽處理采用人工澆鹽水的方式．選取規(guī)格一致的花盆裝入質(zhì)量相同的土，將在光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)至四片子葉的幼苗移栽入土中，每次實(shí)驗(yàn)處理中野生系和轉(zhuǎn)基因系均為32株．在第3周，幼苗長(zhǎng)到約12片葉時(shí)，進(jìn)行即分別在第1、第 5、第 9 天分別澆 100、200、300 mmol/L 的NaCl溶液0．8 L，處理后第12～15天拍照，統(tǒng)計(jì)葉片黃化率．

1．3．8 鹽脅迫葉片鮮重減少率統(tǒng)計(jì) 使用1．3．7中的植株，分別在鹽處理第1、15天統(tǒng)計(jì)葉片蓮座葉子鮮重，統(tǒng)計(jì)葉片鮮重變化率．

1．3．9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)結(jié)果通過(guò)Excel 2003分析，T檢驗(yàn)雙樣本異方差分析．

2 結(jié)果與分析

2．1 突變體的鑒定篩選

根據(jù)abf3和abf4突變體的基因結(jié)構(gòu)圖譜(圖1 A)為依據(jù)合成基因表達(dá)鑒定的引物，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)突變體中ABF3，ABF4基因表達(dá)的電泳圖．a(chǎn)bf3和abf4突變體株系中相應(yīng)突變基因在基因表達(dá)鑒定中均表達(dá)缺失(圖1B)，表明基因組鑒定所得的abf3和abf4突變體植株為單基因缺失表達(dá)的純合子，用于后續(xù)生理實(shí)驗(yàn)．

圖1 abf3和abf4突變體的基因結(jié)構(gòu)圖譜(A)和分子鑒定(B)Figure 1 Schematic diagram(A)and molecular identification(B)of abf3 and abf4

2．2 突變體對(duì)外施ABA的響應(yīng)

種子在光照條件下培養(yǎng)60 h后，abf3、abf4在沒(méi)有ABA處理(對(duì)照)條件下，其萌發(fā)率與Col差別不明顯，經(jīng) 0．1、0．5、1．0 μmol/L ABA 處理的種子，萌發(fā)率均高于Col，均表現(xiàn)為對(duì)ABA不敏感，說(shuō)明外源ABA抑制種子萌發(fā)通過(guò)ABF3和ABF4起作用(圖2)．

在正常生長(zhǎng)條件下，擬南芥各株系綠胚率均為100%;abf3和abf4經(jīng)1μmol/L ABA 處理16 d，其綠胚率高于Col(圖3A)，abf3綠胚率高于abf4植株，表明abf3和abf4顯著降低對(duì)ABA的敏感性，ABF3基因在響應(yīng)ABA信號(hào)途徑中所起的作用比ABF4明顯．

分析ABA處理12 d后突變體和野生型的根長(zhǎng)比率，結(jié)果表明，用20μmol/L或50μmol/L ABA處理abf3的根長(zhǎng)比率都顯著高于Col;而20μmol/L ABA處理的abf4的根長(zhǎng)比率與Col沒(méi)有明顯變化，但50μmol/L處理的abf4的根長(zhǎng)比率低于Col(圖3B)．表明與ABF4比較，ABF3基因的根生長(zhǎng)在響應(yīng)ABA信號(hào)途徑中起到更關(guān)鍵作用的結(jié)果．

abf3、abf4葉片經(jīng)氣孔開放乳液浸泡0．5 h后，其葉片的氣孔開度均比Col略大，但無(wú)明顯差異(圖4A)．10μmol/L ABA 浸泡1 h處理的 abf3、abf4氣孔開率均比Col大，abf4氣孔開率變化僅為10%左右．說(shuō)明 abf3、abf4的氣孔對(duì) ABA的敏感性低于Col．ABF3、ABF4均參與ABA信號(hào)通路對(duì)氣孔開度的調(diào)節(jié)，其中ABF4可能比ABF3起到更關(guān)鍵作用．

2．3 abf3和abf4突變體對(duì)鹽脅迫響應(yīng)

在含100 mmol/L NaCl的1/2MS的培養(yǎng)基培養(yǎng)16 d后，與在正常生長(zhǎng)條件培養(yǎng)結(jié)果相比，abf3和abf4突變體的綠胚率比Col低，abf3對(duì)NaCl的相應(yīng)程度高于abf4(圖5)．在150 mmol/L NaCl處理的abf3根長(zhǎng)比率比Col高．當(dāng)NaCl濃度為200 mmol/L時(shí)，abf3的根長(zhǎng)比率高于Col，而abf4與Col無(wú)明顯差異．總之ABF3對(duì)NaCl的敏感性．

圖2 不同濃度ABA處理對(duì)abf3和abf4突變體萌發(fā)率的影響Figure 2 Effect of applying ABA at different concentration on germination rates in abf3 and abf4 mutants

圖3 不同濃度ABA處理對(duì)abf3和abf4突變體的綠胚率(A)和根長(zhǎng)比率(B)的影響Figure 3 Effect of applying ABA on green cotyledon rates(A)and relative root length(B)in abf3 and abf4 mutants

圖4 ABA處理對(duì)突變體氣孔開度的影響Figure 4 Effect of applying ABA on stomatal aperture in abf3 and abf4 mutants

圖5 NaCl處理對(duì)突變體的綠胚率(A)和主根長(zhǎng)比率(B)的影響Figure 5 Effect of NaCl on green cotyledon rates(A)and relative root length(B)of the ABFmutants and wild-type plants

abf3和abf4突變體在100 mmol/L NaCl處理后葉片的葉綠素含量均大幅度降低，與野生型比較，abf3降低達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明ABF3、ABF4突變體在擬南芥的抗鹽性中發(fā)揮重要作用(圖6)．

擬南芥植株抽薹前在第1、第5、第9天分別用100、200、300 mmol/L 的 NaCl溶液進(jìn)行根處理，3 次處理后第3～6 d，abf3、abf4植株葉片的黃化率均高于Col，且 abf3黃化現(xiàn)象極為明顯(表1)．鹽處理的同時(shí)，稱量第1天、第15天植株蓮座葉的鮮重，abf3、abf4鮮重比正常條件下培養(yǎng)值明顯降低，較Col極為明顯(圖7)．

圖6 NaCl處理對(duì)突變體葉綠素含量的影響Figure 6 Effectof NaCl on total chlorophyll contents inmutants and wild-type plants

表1 鹽脅迫下突變體植株葉片黃化Table 1 Yellowing rates of 3-week-old plants under NaCl stress

3 討論

目前認(rèn)為AREB/ABF轉(zhuǎn)錄因子屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族中的A亞族，N端含有3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域(C1、C2、C3)，C端前端包含1個(gè)高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，結(jié)合DNA和其他蛋白，需要磷酸化修飾被激活［5］．水稻在干旱和高鹽脅迫下，存在類似的AREB/ABF調(diào)節(jié)因子并受到SnRK2磷酸化作用，其中 3個(gè) SnRK2基因被 ABA激活［6］．水稻AREB1類似基因TRAB1被SnRK2蛋白激酶家族成員SAPK磷酸化，通過(guò)迅速磷酸化響應(yīng)ABA［7-8］．

圖7 NaCl處理下突變體葉片鮮重變化率Figure 7 Effect of NaCl on frash weight changing rate in mutants under high salt condition

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在abf3、abf4突變體植株中，葉片氣孔不能關(guān)閉，對(duì)外施ABA信號(hào)不敏感．在突變體抗旱性分析實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)abf3、abf4抗旱性均弱于Col植株，表現(xiàn)低抗旱性，可能與ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力下降有關(guān);KIM等［9］發(fā)現(xiàn)超表達(dá) ABF3或 ABF4/AREB2誘導(dǎo)ABA的超敏感，可提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致．作者推測(cè)ABA應(yīng)答因子如ABF3或ABF4等通過(guò)被SnRK2磷酸化調(diào)節(jié)蛋白活性，而ABF3或ABF4作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合在rd29B、rab18、ICK1、ABI1等眾多基因的啟動(dòng)子區(qū)域［9］，調(diào)節(jié)氣孔開閉，控制水分流失，抵御干旱．正常情況下，擬南芥中ABF3、ABF4在根、葉、花以及未成熟的果莢中均有表達(dá)，且根中表達(dá)量最高，但ABF3在葉中表達(dá)微弱，ABF4在葉中表達(dá)較高［10］，推測(cè)可能也是abf3中，氣孔開度變化較abf4大的原因．

在種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)階段，abf3和abf4突變體植株對(duì)ABA敏感性(萌發(fā)、綠胚)較Col弱，在根長(zhǎng)方面，abf3突變株對(duì) ABA敏感性顯著降低，而abf4對(duì)ABA敏感性與Col無(wú)明顯差異;TAKUYA和YOSHIDA 等［11］通過(guò)對(duì) abf2、abf3、abf4 單突變、雙突變以及三突變的生理表型分析認(rèn)為在萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)階段，轉(zhuǎn)錄因子ABF3在ABA信號(hào)通路中起到關(guān)鍵作用．a(chǎn)bf4對(duì)ABA的敏感性可能是由于ABF2與ABF4功能上的互補(bǔ)［12］，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致．

abf3和abf4突變體對(duì)NaCl脅迫的敏感性大于Col，NaCl處理后突變體葉片葉綠素含量降低，黃化率增加，均表現(xiàn)出對(duì)鹽脅迫的低抗性，其中abf3對(duì)鹽的抗性較 abf4更低．推測(cè) ABF3、ABF4作為SnRK2的底物被磷酸化，調(diào)控下游基因的表達(dá)，在這一過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子ABF3可能起著更關(guān)鍵的作用，有待深入研究．

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