侯燕軍 張雷 吳啟龍 薛利利

分子靶向和免疫治療在治療腫瘤方面取得了重大療效，常用于肺癌的治療。由于吸煙，空氣污染，電離輻射等因素影響，肺癌的發(fā)生率及死亡率逐年上升肺癌占所有癌癥致死人數(shù)的比例超過1/5，并有上升趨勢[1]。本實驗旨在探索生物免疫治療與分子靶向治療的協(xié)同關(guān)系現(xiàn)報道如下:

1 材料與方法

1.1 材料 吉非替尼(國藥準字J20100014)由阿斯利康公司提供;A549人類肺腺癌細胞株由上海研生生物工程有限公司提供;DC-CIK共同培養(yǎng)為我細胞培養(yǎng)室自制，培養(yǎng)基為RPMI-1640由Hyclone提供;MTT儀器為上海華舜生物工程有限公司提供;胎牛血清由杭州四季清公司提供;Annexin-V/FIFC試劑盒由南京凱基生物科技有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 DC-CIK制備 采集健康志愿者外周血離心獲得單個核細胞。反復(fù)凍融裂解法制備抗原。室溫下培養(yǎng)3h后貼壁者做DC細胞培養(yǎng)，未貼壁者做CIK細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)第9天以DC/CIK=1:5進行混合培養(yǎng)。

1.2.2 A549細胞培養(yǎng) 用Hyclone提供的含10%胎牛血清RPMI/1640的培養(yǎng)液于37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)A459細胞，2 d/次換液。細胞成片后作1/2傳代。

1.2.3 細胞抑制率測定 將對數(shù)期生長的A549細胞用MTT法計數(shù)后種于96孔板內(nèi)，標準為每孔0.5×105。分為DC-CIK組、吉非替尼組、DC-CIK聯(lián)合吉非替尼A、B組(A組吉非替尼6.9umol/L;B組非替尼13.8umol/L)，培養(yǎng)24h待A549細胞貼壁，取出培養(yǎng)板，去除培養(yǎng)液，洗滌2～3次后，堿化標本，在570nm處測定OD值，每組實驗取4孔求平均值，根據(jù)添加藥物前后細胞計數(shù)的變化計數(shù)每組的抑制率。

1.2.4 細胞周期及凋亡情況測定 ①細胞凋亡測定:取對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)后，收集細胞以1500r/min離心 5 min，棄上清，加入10 μl AnnexinV-FITC 和5μlPI輕輕混勻;室溫避光孵育 15min，后進行流式細胞儀檢測，CellQuest軟件分析細胞凋亡率。②細胞周期測定:取對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板中。收集細胞，用冰PBS洗2遍，70%冰乙醇固定標本24 h后重復(fù)用冰PBS洗2遍，用500ul Binding Buffer重懸細胞。加入RNA酶使其終濃度達到100 μg/ml，后37℃水浴30 min，最后加入 PI使其濃度達50 μg/ml后4℃避光30 min，流式細胞儀檢測分析細胞周期。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0對觀察的數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果

吉非替尼組對A549細胞的抑制率最低為(37.19±1.5)%，DC-CIK聯(lián)合吉非替尼B組抑制率最高為(69.62±2.30)%，各組實驗結(jié)果差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。

表1 各組實驗對A549細胞的周期凋亡影響(%)

表2 各組實驗對A549細胞的周期凋亡影響(%)

3 討論

隨著社會科技的迅猛發(fā)展，環(huán)境污染逐漸嚴重加上吸煙等因素導(dǎo)致肺癌發(fā)病率逐年上升，非小細胞肺癌占肺癌總數(shù)的80%～85%，所以非小細胞肺癌的治療已是迫在眉睫的重要任務(wù)。樹突狀細胞(DC)是最有效的抗原呈遞細胞，能攝取、加工并呈遞抗原給T細胞引發(fā)細胞免疫。CIK細胞是免疫反應(yīng)中的非特異性殺傷細胞，可由多種細胞因子誘導(dǎo)T細胞分泌，CIK細胞可迅速分泌多種免疫因子參與免疫反應(yīng)。而將樹突狀細胞與CIK細胞聯(lián)合培養(yǎng)后可促進CIK細胞成熟，增強CIK細胞的殺傷力可以確保高效的免疫反應(yīng)[2]。吉非替尼是酪氨酸激酶的抑制劑，用于非小細胞肺癌的治療。兩者合用對非小細胞肺癌起明顯作用的機制可能因為腫瘤相關(guān)成纖維細胞(TAFs)活化受到抑制的因素。因為腫瘤相關(guān)成纖維細胞活化后會促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移擴散，增加了腫瘤細胞的惡性表型，并對腫瘤血管的生長，浸潤起促進作用。對于兩者如何作用于腫瘤相關(guān)成纖維細胞筆者將進一步實驗論證。

[1]尤長宣，李金瀚.28例吉非替尼一線治療老年非小細胞肺癌的臨床經(jīng)驗．中國腫瘤臨床，2010，37(11):34-35．

[2]葛薇，張偉.樹突細胞與細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞共培養(yǎng)增強其體內(nèi)外抗腫瘤活性．中華血液學(xué)雜志，2004，25(5):117．