亓瑩

耐藥結(jié)核病已成為結(jié)核病防控、治療工作面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。目前耐藥結(jié)核病的診斷主要依靠結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，不能滿足臨床需要。異煙肼、利福平作為一線抗結(jié)核藥物，其耐藥性分子機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)。有報(bào)道指出結(jié)核分支桿菌對(duì)異煙肼耐藥是由結(jié)核分支桿菌中過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶的編碼基因KatG基因的突變所致，與inhA基因突變也存在著密切聯(lián)系。我們采用PCR擴(kuò)增、核酸雜交檢測(cè)方法對(duì)102株臨床結(jié)核桿菌分離株和35例結(jié)核患者菌陽(yáng)痰標(biāo)本進(jìn)行KatG、inhA基因突變檢測(cè)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 42株對(duì)異煙肼敏感的菌株，60株對(duì)異煙肼耐藥菌株、35例耐異煙肼或含耐異煙肼的肺結(jié)核患者菌陽(yáng)菌陽(yáng)痰標(biāo)本來(lái)自我院就診的結(jié)核患者。異煙肼敏感株、耐藥株均通過(guò)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核分枝桿菌DNA模板的制備 刮取少量標(biāo)本，加入100ulTE中，100℃ 煮沸10min，立即置于冰上2min，10000rpm離心10min，取上清備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 采用20ul反應(yīng)體系，Bio-標(biāo)記引物，擴(kuò)增程序?yàn)?經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸，30次循環(huán)，最后延伸72℃、10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(10ug/ml)。凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，出現(xiàn)267 bp條帶。

1.2.3 雜交檢測(cè) 將點(diǎn)有探針的硝酸纖維素雜交膜裝入雜交袋中，加入雜交液進(jìn)行預(yù)雜交:45℃、20min。將上一步PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物95℃、10min變性，取出迅速放入冰盒中，取變性擴(kuò)增產(chǎn)物加入雜交袋中，每ml雜交液加l5ul變性的擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行分子雜交:45℃、60 min。取出硝酸纖維素雜交膜，洗膜三次、加入顯色試劑顯色、與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)比觀察報(bào)告結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果 35例耐異煙肼肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中，KatG基因擴(kuò)增陽(yáng)性有30例、inhA基因擴(kuò)增陽(yáng)性27例。應(yīng)用PCR擴(kuò)增、核酸雜交檢測(cè)方法檢測(cè)KatG、inhA基因突變率分別為43.3%(13/30)、3.7%(1/30)。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)35例痰標(biāo)本的KatG、inhA基因突變檢測(cè)結(jié)果

2.2 結(jié)核分支桿菌臨床分離株的檢測(cè)結(jié)果 42株對(duì)異煙肼敏感菌株的KatG、inhA基因突變率分別為4.8%(2/42)、0。60株對(duì)異煙肼耐藥菌株中，38株發(fā)生KatG基因突變，突變率為61.6%;3株發(fā)生inhA基因突變，突變率為5.0%。

表2 對(duì)102例臨床分離株的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

耐藥結(jié)核病已經(jīng)成為我國(guó)結(jié)核病控制的一大難題，若不能有效遏制耐藥結(jié)核分枝桿菌的播散和流行，將會(huì)使更多人感染耐藥結(jié)核分枝桿菌并形成新的傳染源，應(yīng)盡快提高我國(guó)耐藥結(jié)核病的診斷水平，引入新的快速、可靠和便捷的耐藥結(jié)核病的診斷技術(shù)，縮短耐藥結(jié)核病的診斷時(shí)間。研究表明結(jié)核分支桿菌耐異煙肼的分子機(jī)制是過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變所致，與inhA基因突變也存在密切聯(lián)系。本文通過(guò)PCR擴(kuò)增、核酸雜交方法進(jìn)行KatG、inhA基因突變檢測(cè)，使耐藥性檢測(cè)時(shí)間由2～3個(gè)月縮短到2～3 d。

PCR擴(kuò)增、核酸雜交技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的KatG、inhA基因突變，42株對(duì)異煙肼敏感菌株中，發(fā)生KatG基因突變的2株，沒(méi)有inhA基因突變。發(fā)生KatG、inhA基因突變率分別為4.8%、0。60株對(duì)異煙肼耐藥菌株中，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，發(fā)生KatG基因突變38株，突變率為61.6%;發(fā)生inhA基因突變3株，突變率為5.0%，突變類型均為點(diǎn)突變。對(duì)異煙肼耐藥的肺結(jié)核患者菌陽(yáng)痰標(biāo)本中，KatG、inhA基因突變檢出率分別為43.3%(13/30)、3.7%(1/27)，略低于臨床分離株，這與相關(guān)報(bào)道一致。由于本實(shí)驗(yàn)中有4.8%的敏感株也存在突變，說(shuō)明KatG、inhA基因突變是導(dǎo)致異煙肼耐藥的主要原因，但有部分菌株的耐異煙肼形成可能與KatG、inhA基因缺失、突變無(wú)關(guān)，還需要進(jìn)一步研究探討。本實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了大部分結(jié)核分支桿菌對(duì)異煙肼耐藥是由KatG基因、inhA基因的突變所決定。

本文建立一種新的快速，有效的對(duì)異煙肼耐藥的分子檢測(cè)方法。為耐藥結(jié)核病的早期診斷、早期治療具有重要的意義。應(yīng)用PCR擴(kuò)增和核酸雜交檢測(cè)技術(shù)也可以直接檢測(cè)菌陽(yáng)痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌KatG、inhA基因突變情況，來(lái)判斷結(jié)核分支桿菌異煙肼的耐藥性，為耐藥、耐多藥肺結(jié)核提供診斷依據(jù)。